四妙勇安湯提取物抑制巨噬細胞NF-κB活化和MMP-9分泌的初步研究1）

朱海燕，聶 波，徐 冰，劉 蓓，吳圣賢，陳立新

四妙勇安湯是用于治療下肢動脈閉塞癥和脈管炎的傳統名方，由于其活血祛瘀、通絡止痛的作用與冠心病心絞痛的病因病機相吻合，故在臨床亦觀察到其可改善冠心病心絞痛患者的臨床癥狀［1］。本課題組前期研究已證實，四妙勇安湯對治療冠心病不穩定型心絞痛患者臨床癥狀具有較滿意的療效。但因原方中藥量過大，給新藥開發帶來難度。本實驗采用對易損斑塊穩定性起重要作用的巨噬細胞為研究對象，通過對NF-κB活化和基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）分泌的測定，探索四妙勇安湯的有效組分，為藥物的下一步研發提供基礎實驗數據。

1 材料與方法

1.1 細胞 小鼠巨噬細胞系（RAW264.7細胞），中國醫學科學院藥物研究所，96孔白色底透培養板（Costa）。

1.2 試劑及耗材 640培養基，小牛血清，LPS（Sigma），MMP-9 ELISA試劑盒（Jiamay Biotech Co），水套式CO2細胞培養箱（Sanyo，日本），Safire2高速多通道連續波長酶標儀（TECAN，奧地利），Bright-Glo Luciferase熒光素酶檢測試劑（Promega），48孔和96孔培養板（Costar）。

1.3 樣品制備 “四妙勇安湯”提取物共8個。方法：原料藥材55%乙醇提取2次，1.5h／次，得到55%乙醇提取液和殘渣，55%乙醇提取液濃縮至干，水混懸，上大孔樹脂，連續依次采用水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇淋洗，分別獲得水部位、30%乙醇部位、60%乙醇部位、95%乙醇部位，分別減壓濃縮干燥，得到篩選樣品2號～5號；殘渣用水提2次，1.5h／次，得到水提液，留取部分水提液濃縮至干得到樣品1，其余用水混懸，上大孔樹脂，連續依次采用水、55%乙醇、95%乙醇淋洗，分別獲得水部位、55%乙醇部位、95%乙醇部位，分別減壓濃縮干燥，得到篩選樣品6號～8號。

1.4 細胞培養、造模方法和抑制率的檢測 RAW264.7細胞在37℃、5%CO2及飽和濕度環境下培養于含10%小牛血清1640培養基中。將培養瓶內對數生長的RAW264.7細胞消化并計數，以10×104／well的密度接種于48孔培養板中。模型制備前，換以等體積無血清1640培養基，待篩樣品與細胞預先孵育1h。模型制備時，每孔加入終濃度為5μg／mL LPS，與細胞共同作用24h，收集細胞上清，之后每孔加入50μL Bright-Glo Luciferase熒光素酶檢測試劑，室溫避光震蕩5min，置于多功能酶標儀中，設定光化學檢測程序進行檢測。該模型以熒光素酶光化學值的變化直接指示樣品對NF-κB-RE是否有阻斷作用。因此，通過計算抑制率，可確定樣品在NF-κB信號通路中對早期基因表達阻斷作用的強弱。

以ELISA法檢測MMP-9含量。根據ELISA說明書逐步操作，最后在酶標儀450nm處讀出OD值。以標準品濃度為橫坐標，以OD 450值為縱坐標，繪制濃度OD450標準曲線。根據樣品的OD值從標準曲線上查出待測樣品作用后的濃度，并通過與模型組比較，觀察樣品對MMP-9的抑制作用。

1.5 統計學處理 用SPSS13.0分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示。

2 結 果

2.1 細胞上清液中MMP-9的含量測定 在正常培養的RAW264.7細胞上清中，MMP-9含量較低；LPS作用24h后，MMP-9含量顯著增高。初篩結果顯示，1、2、3、4、6、7、8號提取物能夠降低細胞上清MMP-9含量，提示可能具有降低RAW264.7細胞中MMP-9產生及分泌的作用，故對上述7種提取物進行復篩。復篩結果顯示，1、2、4號提取物在5μg／mL～100μg／mL濃度范圍內能夠明顯降低LPS作用后MMP-9的分泌，具有濃度依賴關系；3、6號提取物在5μg／mL～50μg／mL濃度范圍內能夠明顯降低LPS作用后MMP-9的分泌，具有濃度依賴關系；7、8號提取物在5μg／mL～25μg／mL范圍內能夠明顯降低LPS作用后MMP-9的分泌，具有濃度依賴關系。（注：7、8號提取物在50μg／mL時即出現細胞毒性作用，故復篩時二者濃度均未高于50μg／mL）。

表1 提取物對LPS致巨噬細胞損傷模型上清MMP-9含量的影響（x±s，n=3）

2.2 提取物對NF-κB反應原件結合抑制劑篩選模型的作用1、2、3、4、6、7號提取物對 NF-κB信號通路具有阻斷作用，能夠通過抑制早期基因表達而抑制該病理信號通路。（注：8號提取物在100μg／mL和50μg／mL時出現細胞毒性作用，故計算濃度未高于50μg／mL）。詳見表2。

表2 提取物對NF-κB反應原件結合抑制劑篩選模型的作用（x±s，n=3）

3 討 論

隨著“動脈粥樣硬化炎癥反應”學說的公認，清熱解毒中藥已成為治療冠心病的常用中藥［2］。四妙勇安湯配伍精當，藥專力宏，是最具中醫配伍和用量特色的藥物之一，由金銀花、玄參、當歸、生甘草組成，具有抑菌、消炎、促進血液循環等作用，常用于治療氣滯血瘀、靜脈阻塞而發的脈管炎、血栓閉塞性脈管炎［3］。而冠心病心絞痛的基本病機是氣虛血瘀，病理機制為絡脈癖阻細急而痛［4］，與四妙勇安湯方證相吻合。四妙勇安湯可改善冠心病心絞痛患者的臨床癥狀［1］。本課題組前期研究也證實，對冠心病不穩定型心絞痛患者臨床癥狀具有較滿意的療效。

本實驗采用巨噬細胞系RAW264.7細胞作為研究材料，并通過LPS刺激活化巨噬細胞。在眾多的炎細胞中，巨噬細胞對斑塊穩定性的作用尤為重要。活化的巨噬細胞除了是形成動脈粥樣硬化病變的主要組成部分，還可在炎癥因子的刺激下分泌基質金屬蛋白酶，降解斑塊中的膠原和細胞外基質成分，使纖維帽變薄，易于形成不穩定性斑塊。其中，最主要的是MMP-9，它對細胞外基質合成與降解的平衡起重要作用，其在冠狀動脈動脈壁和外周血中的增加程度與病變嚴重程度正相關［5］。本次實驗結果顯示：四妙勇安湯的1、2、4號提取物在5μg／mL～100 μg／mL濃度范圍內能夠明顯降低LPS作用巨噬細胞系RAW264.7細胞后MMP-9的分泌，具有濃度依賴關系；3、6號提取物在5μg／mL～50μg／mL濃度范圍內能夠明顯降低LPS作用后MMP-9的分泌，具有濃度依賴關系；7、8號提取物在5 μg／mL～25μg／mL范圍內能夠明顯降低LPS作用后 MMP-9的分泌，具有濃度依賴關系。結果提示四妙勇安湯的部分提取物可抑制巨噬細胞分泌MMP-9，因此可能具有減少斑塊基質降解，穩定斑塊的作用。

MMP-9主要在轉錄水平受NF-κB、AP-1等多種轉錄因子的調節［6］，目前許多學者認為NF-κB的激活是動脈粥樣硬化發生、發展的始動機制之一［7］。本研究選擇不穩定型心絞痛易損斑塊炎癥反應的核心病理環節——NF-κB，對四妙勇安湯全部連續組分進行高通量篩選，發現四妙勇安湯抑制NF-κB信號通路的有效部位分別為位1、2、3、4、6、7。其中有效部位2、3、4的IC50值較低，表明抑制效果最好。

綜合MMP-9和NF-κB被抑制的結果可發現，四妙勇安湯有效部位1、2、3、4、6的作用較為安全可靠。此外，在篩選出中藥有效部位的基礎上進一步優化中藥配伍和配比關系，對于進一步開發抗不穩定型心絞痛、穩定易損斑塊有效中藥具有重要意義。

［1］ 許恒忠，李金英，蘇子德.四妙永安湯加味治療冠心病心絞痛的療效觀察［J］.邯鄲醫學高等專科學校學報，2005，18（1）：45-46.

［2］ 吳同和.清熱解毒法對不穩定性心絞痛患者C反應蛋白的影響［J］.吉林中醫藥，2006，26（11）：43-44.

［3］ 賴天松.中西醫匯通常用方劑［M］.廣州：廣東科技出版社，1999：117.

［4］ 吳以嶺.從絡病學說論治冠心病心絞痛［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2001，7（4）：71.

［5］ Gough PJ，Gomez IG，Wille PT，et al.Macrophage expression of active MMP-9induces acute plaque disruption in apoE-deficient mice［J］.J Clin Invest，2006，116（1）：59-69.

［6］ Luttun A，Lutgens E，Manderveld A，et al.Loss of matrix metalloproteinase-9or matrix metalloproteinase-12protects apolipoprotein E-deficient mice against atherosclerotic media destruction but differentially affects plaque growth［J］.Circulation，2004，109（11）：1408-1414.

［7］ Zandi E，Chen Y，Karin M.Direct phosphorylation of IkappaB by IKKalpha and IKKbeta：Discrimination between free and NF-kappaB-bound substrate［J］.Science，1998，281（5381）：1360-1363.