陰虛血虧大鼠模型血管活性腸肽表達(dá)及心肌超微結(jié)構(gòu)的改變

李 浩

心血管調(diào)節(jié)肽廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)，是一個(gè)非常復(fù)雜、非常龐大的神經(jīng)體液調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。從這些生物活性物質(zhì)的分布和作用來(lái)看，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)之間的功能關(guān)系密切。血管活性腸肽（vasoacitve intestinal peptide，VIP）對(duì)循環(huán)系統(tǒng)具有擴(kuò)張血管、降低血壓、增加心率、增強(qiáng)心肌收縮力和舒張冠脈血管的作用［1］，與其受體垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽特異性結(jié)合，還具有抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖的作用，與多種心血管疾病密切相關(guān)，如高血壓病、心肌病、心力衰竭等。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠20只，體重200g±20g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供，批號(hào)：00002829。隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組，每組10只。實(shí)驗(yàn)前將各組大鼠放在同一籠中適應(yīng)飼養(yǎng)2周，自由攝食、飲水。室溫和水溫均控制在22℃～24℃。

1.2 試劑及藥物 D-半乳糖：上海試劑二廠生產(chǎn)，批號(hào)為070124；咖啡因：購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；VIP抗兔／鼠通用型免疫組化試劑盒，購(gòu)自 Gene tech company limited，貨號(hào)為GK500705；其他如10%水合氯醛、2.5%戊二醛、10%多聚甲醛、1%四氧化鋨等為市售常用試劑。

1.3 儀器 日立H-600型透射電鏡（日本日立公司），LKB-V型超薄切片機(jī)（瑞典BROMMA公司）。

1.4 方法

1.4.1 陰虧血虛大鼠模型的建立 參照文獻(xiàn)［2］方法制作陰虧血虛大鼠模型，模型組按60mg／（kg·d）標(biāo)準(zhǔn)頸背部皮下注射D-半乳糖4周，按30mg／（kg·d）標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射咖啡因1周，空白對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)。所用動(dòng)物給藥時(shí)間均為每晚18：00。

1.4.2 免疫組化法測(cè)定模型大鼠心臟VIP 各組大鼠處理完畢，用10%水合氯醛0.3mL／100g麻醉大鼠，處死大鼠。迅速打開(kāi)胸腔摘取心臟，置4℃預(yù)冷勻漿介質(zhì)中洗去殘血。由右室游離壁沿心臟長(zhǎng)軸切開(kāi)，取小塊心肌用10%多聚甲醛溶液固定48h以上，自來(lái)水沖洗48h，逐級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋。以4%多聚甲醛溶液300mL灌注約30min內(nèi)固定。取腦，放入4%多聚甲醛溶液中固定48h。自來(lái)水沖洗12 h，經(jīng)70%、80%、95%酒精梯度脫水各12h，正丁醇脫水6h。取出組織，低溫（60℃）浸蠟過(guò)夜，包埋、連續(xù)切片，片厚4μm，切片每隔3張取1張。

石蠟切片置于65℃烘箱中，烘片2h，用PBS（pH7.4）沖洗3次，每次5min；EDTA微波修復(fù)；自然冷卻后PBS（pH7.4）洗3次，每次5min；切片放入3%過(guò)氧化氫溶液，室溫下孵育15 min；PBS（pH7.4）洗3次，每次5min；甩去 PBS液，加第一抗體；每張切片加入約50μL稀釋液，4℃過(guò)夜；PBS（pH7.4）洗3次，每次5min；甩去PBS液，每張切片加50μL～100μL新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡控制顯色；顯色完全后，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化1min，自來(lái)水沖洗，氨水返藍(lán)1 min，流水沖洗；切片經(jīng)過(guò)梯度酒精70%、80%、95%脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

圖像采集每組取8份標(biāo)本，各隨機(jī)取5個(gè)視野，顯微鏡下觀察，采用HPIAS-1000多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)，對(duì)免疫組化VIP陽(yáng)性細(xì)胞（胞體完整，染色呈棕色或深棕色）進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4.3 心肌組織電鏡標(biāo)本的制備 如前各組大鼠處理完畢，取小塊心肌用2.5%戊二醛前固定24h，0.1mol／L磷酸緩沖液漂洗3次，鋨酸（OsO41%）后固定24h，0.1mol／L磷酸緩沖液漂洗3次，梯度酒精脫水（50%、70%、80%、95%、100%二次）每次15min，純丙酮脫水二次（15min），EPON812：丙酮（1∶1）浸透30min，純包埋液浸透1h，純包埋液固化37℃24h后60℃48 h，切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠VIP水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表1）

表1 天王補(bǔ)心丹對(duì)大鼠血漿VIP水平的影響（x±s）

2.2 心肌組織透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)的改變 空白對(duì)照組心肌細(xì)胞核大，肌原纖維清晰規(guī)整，橫紋清楚，肌節(jié)無(wú)皺縮；胞質(zhì)內(nèi)肌漿網(wǎng)正常，無(wú)管壁溶解；線粒體排列整齊，內(nèi)、外膜完整，基質(zhì)密度適中，線粒體嵴完整，排列整齊。模型組大鼠心肌組織的改變有：心肌肌絲排列紊亂、斷裂，肌小節(jié)排列紊亂、斷裂；大部分心肌細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常，少數(shù)細(xì)胞核可見(jiàn)濃縮變小，染色質(zhì)輕度溶解及凝聚，核膜皺縮尚完整；大部分線粒體形成高電子密度狀，內(nèi)、外膜及嵴結(jié)構(gòu)模糊，不清晰；肌漿網(wǎng)囊性擴(kuò)張，成大囊泡狀，部分肌漿網(wǎng)破裂。

3 討 論

近年來(lái)，關(guān)于VIP和心血管系統(tǒng)關(guān)系的研究越來(lái)越多。心臟及血管活動(dòng)受神經(jīng)、體液等多種因素調(diào)控，VIP是重要的肽類神經(jīng)遞質(zhì)之一，其在心血管系統(tǒng)中也有著廣泛的分布，對(duì)心臟血管活動(dòng)有重要的調(diào)節(jié)作用。現(xiàn)代研究證明，VIP通過(guò)結(jié)合VIPC1、VIPC2、PAC1特異性受體，激活cAMP依賴蛋白激酶A（PKA），cGMP依賴蛋白激酶G（PKG）等多種途徑起到調(diào)節(jié)血管的作用［3-5］。同時(shí)，VIP對(duì)心臟活動(dòng)也有著重要的調(diào)節(jié)作用。有實(shí)驗(yàn)證明VIP可以加快心率［6］。并在心力衰竭的發(fā)病發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。其作用機(jī)制與VIP參與恢復(fù)血液動(dòng)力平衡、提高心肌功能、對(duì)抗其他神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)如腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活引起的副反應(yīng)有關(guān)［7，8］。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，模型組VIP含量顯著升高，而同時(shí)心肌結(jié)構(gòu)受到損害，電鏡觀察心肌的超微結(jié)構(gòu)顯示心肌肌絲排列紊亂、斷裂，少數(shù)細(xì)胞核可見(jiàn)濃縮變小，染色質(zhì)輕度溶解及凝聚，核膜皺縮，線粒體形成高電子密度狀，嵴結(jié)構(gòu)模糊，不清晰，肌漿網(wǎng)囊性擴(kuò)張，成大囊泡狀，部分肌漿網(wǎng)破裂。VIP作為參與心衰發(fā)生發(fā)展的重要體液因子，提示模型組大鼠可能已經(jīng)出現(xiàn)心功能不全。而VIP可能參與了心肌結(jié)構(gòu)損害的過(guò)程。

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