解毒通絡方含藥血清對大鼠血管成纖維細胞釋放ET、NO、MMP-9的影響1）

魏陵博，戎冬梅，李運倫，遲立萍，鐘志歡，吉中強，焦華琛

成纖維細胞（CFs）增殖是多數(shù)心臟疾患病理改變的基礎(chǔ)。成纖維細胞具有分泌功能，能夠分泌釋放內(nèi)皮素（ET）、一氧化氮（NO）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）可導致細胞外基質(zhì)的過度降解，ET 可誘導心肌細胞肥大和刺激膠原合成，能加重心臟經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）后再狹窄的發(fā)生，一氧化氮（NO）是保護性因子，有阻止再狹窄發(fā)生的作用。本研究用解毒通絡方含藥血清干預新生大鼠主動脈成纖維細胞的培養(yǎng)，測定培養(yǎng)液血清中 MMP、ET、NO的含量，初步揭示該方對再狹窄的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 1d～4d齡新生清潔級SD大鼠，雌雄不限，購自山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.1.2 實驗藥品 解毒通絡方合劑組成：黃連12g，大黃3g，連翹15g，野葛根30g，水蛭6g，地龍12g。由山東中醫(yī)藥大學中藥學院按制備合劑的常規(guī)方法制成滅菌合劑，1mL相當于生藥材1g。

含藥血清制備：取健康Wistar雄性大鼠12只，灌服解毒通絡方合劑，每次按2mL／100g的體積給藥（大約相當于60kg成人日劑量的15倍）。灌胃前12h禁食不禁水，每日1次，連續(xù)給藥7d。于末次給藥2h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，無菌條件下腹主動脈取血，置無菌試管內(nèi)。待凝固后37℃水浴1h，3 000r／min，離心15min，分離血清，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩ＥR用時，56℃恒溫30min滅活，0.22μm微孔濾膜過濾除菌。含藥血清呈淡黃清亮透明液體。

卡托普利：濟南東風制藥有限公司產(chǎn)品，用DMEM／F12培養(yǎng)基溶解、過濾除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑 AngⅡ、胰蛋白酶，Sigma公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基，賽默飛世爾生物化學制品有限公司產(chǎn)品；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；NO酶聯(lián)免疫測定試劑盒，美國R＆D公司產(chǎn)品；內(nèi)皮素酶聯(lián)免疫測定試劑盒，美國R＆D公司產(chǎn)品；波形蛋白單克隆抗體產(chǎn)品、纖維連接蛋白單克隆抗體產(chǎn)品、α-肌動蛋白單克隆抗體產(chǎn)品和SABC試劑盒，均為武漢博士德工程有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 實驗儀器 EL340I全自動酶標儀，美國Biotok公司產(chǎn)品；BB16uv／BB5060uv CO2培養(yǎng)箱，Heraeus公司產(chǎn)品；超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司產(chǎn)品；XDS-1B型倒置顯微鏡，重慶光電公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與鑒定 采用組織貼塊法培養(yǎng)大鼠胸主動脈成纖維細胞，胰蛋白酶消化法作傳代培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察并作血管成纖維細胞α-actin和Vimentin免疫細胞化學染色進行鑒定，選用4～8代血管成纖維細胞用于實驗。

1.2.2 細胞分組與干預 胰蛋白酶消化制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×106／L，接種于培養(yǎng)板／瓶備用。經(jīng)48h預培養(yǎng)和24h無血清培養(yǎng)基預處理后，隨機分組。①DMSO溶媒對照組：10%FBS的DMEM培養(yǎng)基、1%DMSO，不加特殊處理因素；② AngⅡ組：AngⅡ終濃度為2×10-7mol／L、10%FBS的DMEM培養(yǎng)基；③卡托普利組：AngⅡ終濃度為2×10-7mol／L＋卡托普利400mg／L；④含藥血清高、中、低、極低劑量組：AngⅡ終濃度為2×10-7mol／L＋含藥血清20%、15%、10%、5%。繼續(xù)培養(yǎng)24h，胰蛋白酶消化培養(yǎng)細胞。

1.2.3 細胞培養(yǎng)液ET、NO和MMP-9含量的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法，具體步驟見試劑盒說明書。

1.2.4 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差不齊時采用秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠胸主動脈成纖維細胞培養(yǎng)結(jié)果 CFS為貼壁生長型細胞，CFS呈長梭形或不規(guī)則多角形，細胞質(zhì)透明，向外伸出2個～3個長短不一的突起，胞核比較大，細胞界限較清楚，生長排列較規(guī)律，多呈放射狀、編織狀或螺旋狀走行。成纖維細胞α-actin和Vimentin免疫細胞化學染色，發(fā)現(xiàn)細胞Vimentin單抗染色陽性，胞漿中有棕黃色絲狀網(wǎng)絡及顆粒，而α-actin單抗染色表達陰性。

2.2 各組培養(yǎng)液中ET、NO、MMP-9水平比較（見表1）

表1 解毒通絡合劑含藥血清對大鼠血管成纖維細胞ET、NO、MMP-9的影響（x±s）

3 討 論

PCI已逐漸成為治療冠狀動脈硬化性血管內(nèi)狹窄的有效方法，但是，超過15%的冠狀動脈支架置入患者在一年內(nèi)因為支架內(nèi)再狹窄而接受新的介入治療［1］。賈國良等［2］認為PCI后冠狀動脈再狹窄與冠狀動脈對血管成形損傷的過度修復有關(guān)，支架置入幾分鐘后內(nèi)膜表面就覆蓋一層纖維蛋白原，并伴有血小板的黏附、聚集、活化，誘發(fā)中膜與外膜平滑肌細胞和成纖維細胞向內(nèi)膜遷移、增殖，并合成大量的細胞外基質(zhì)，發(fā)生基質(zhì)改建，幾周后被顯微平滑肌細胞和纖維細胞組織代替，形成新生內(nèi)膜，發(fā)生內(nèi)皮化。

陳康玉等［3］指出，炎癥反應參與了從早期的血管損傷到最終的內(nèi)膜增生等整個再狹窄過程。

既往研究證明［4，5］，解毒通絡方劑能有效減輕大鼠炎癥性尾部血栓形成，能明顯降低動物血清中IL-1的含量，對不穩(wěn)定型心絞痛有較好的療效，既能對抗炎癥因子，又有抗血栓形成作用，符合冠狀動脈支架內(nèi)再狹窄的機制。本研究觀察其對成纖維細胞產(chǎn)生MMP-9、ET、NO的作用，以期揭示對再狹窄發(fā)生的影響。

本研究顯示，解毒通絡方含藥血清各個劑量組與卡托普利組都能顯著降低大鼠主動脈成纖維細胞ET的含量，增加NO含量，ET是目前已知的體內(nèi)作用最強的縮血管活性多肽，具有明確的促平滑肌細胞增殖的作用，在心血管疾病中起著重要作用，特別是與心肌纖維化有密切的關(guān)系［6］。NO具有舒張血管，抑制血小板黏附聚集的作用。有證據(jù)表明［7］PTCA／支架術(shù)后血小板生成的NO顯著減少，而且NO合成酶和L-精氨酸（L-Arg）的跨膜運轉(zhuǎn)也降低，NO由左旋精氨酸氧化途徑產(chǎn)生，其合成限速酶NO調(diào)節(jié)著NO的合成與釋放。

MMPs是一類鋅依賴性蛋白酶家族，有20余種，主要包括MMP-1、MMP-2和 MMP-9。MMP-s是降解細胞外基質(zhì)成分的主要酶類，其活性的增加能促進動脈粥樣硬化形成中基質(zhì)的重建。Ikeda等［8］研究表明，支架術(shù)后冠脈再狹窄組 MMP-2和MMP-9的水平均明顯高于術(shù)后血管正常組，上述指標隨冠脈再狹窄的加重程度進一步升高。

多項研究表明，血清MMP-9水平在冠心病心絞痛患者中明顯升高，病情越重，升高越顯著，血清MMP-9水平增高與冠狀動脈病變程度密切相關(guān)［9，10］。本實驗顯示，高劑量組與卡托普利組均能顯著降低MMP-9的水平，其他劑量組無此作用。

再狹窄是冠心病介入治療后的主要遠期并發(fā)癥。在再狹窄的發(fā)生過程中，ET、NO、MMP-9均是重要的細胞因子。本研究觀察了解毒通絡法對新生大鼠CFs分泌的ET、NO、MMP-9的作用，證明解毒通絡法是通過降低ET／NO值、降低MMP-9水平來實現(xiàn)防止再狹窄的。

［1］ Radke PW，Kaiser A，F(xiàn)rost C，et al.Outcome after treatment of coronary in-stent restenosis；Results from a systematic review using meta-analysis techniques［J］.Eur Heart J，2003，24（3）：266-273.

［2］ 賈國良，呂安林，王小燕，等.冠狀動脈再狹窄的靶血管局部影響因素［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2002，23（2）：97-99.

［3］ 陳康玉，嚴激.冠狀動脈支架內(nèi)再狹窄的炎癥機制和抗炎治療［J］.心血管康復醫(yī)學雜志，2009，18（1）：88-90.

［4］ 魏陵博，戎冬梅，彭敏，等.解毒通絡合劑治療不穩(wěn)定型心絞痛的臨床研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2007，5（7）：568-570.

［5］ 戎冬梅，魏陵博，彭敏，等.解毒通絡合劑對角叉菜膠所致大鼠血栓形成的影響［J］.中國中醫(yī)急癥雜志，2008，17（5）：660-661.

［6］ Sun Y，Ratajska A，Zhou G，et al.Angiotensin converting enzyme and myocardial fibrosis in the rat receiving anglotensinⅡor aldosterone［J］.J Lab Clin Med，1993，122：395-403.

［7］ Azuma W，Ishikawa M，Sekizaki S.Endothelium dependent inhibition of platelet aggregation［J］.Br J Pharm，1986，88：411-415.

［8］ Ikeda U，Shimada K.Matrix metalloproteinses and coronary artery diseases［J］.Clin Cardiol，2003，26（2）：55-59.

［9］ 黃妍.血清 MMP-9、CRP、UA及IL-6、IL-8、TNF-α在老年冠心病診斷中的意義［J］.細胞與分子免疫學雜志，2010，26（9），923-924.

［10］ 潘軼斌，包麗芳，張懷勤.血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9與冠狀動脈病變程度的關(guān)系［J］.福建醫(yī)藥雜志，2006，28（3）：18-20.