片仔癀對局灶性腦梗死大鼠水通道蛋白4（AQP4）表達的影響1）

李 倩，黃希艷，朱陵群

腦血管病是目前發病率極高的一類疾病，具有三高一低的特點。腦水腫是其發展過程中的重要病理環節，可致顱內壓升高，甚至形成腦疝，導致死亡，嚴重影響著該病的預后。腦水腫即中樞神經系統的水液代謝失常，目前常用的治療方法包括滲透性脫水及外科手術減壓等。本文著眼于片仔癀在缺血性腦血管病所致腦水腫領域的應用，并對其作用機制進行探索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級SD大鼠，雄性，體重260g～280g，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證編號：SCXK-（軍）2007-004。水通道蛋白4（AQP4）試劑盒及DAB顯色試劑盒，均購置于武漢博士德生物工程有限公司。尼莫地平片：拜耳醫藥保健有限公司，國藥準字：H20003010，產品批號：BJ00604，規格：每片含30mg；腦得生片：廣東國醫堂制藥股份有限公司生產，批號：110101，糖衣片，片芯重0.3g，每盒72片；片仔癀，漳州片仔癀藥業股份有限公司，批號：0711050；

1.2 實驗方法 隨機將大鼠分為模型組，假手術組，片仔癀大中、小劑量組，尼莫地平組和腦得生組，每組動物10只。除假手術組外，其余各組均采用改良的Longa方法制備大鼠大腦中動脈局灶性腦梗死模型（MCAO）。分離出頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內動脈（ICA），結扎ECA及CCA近心端，動脈夾暫時夾閉ICA遠心端，用虹膜剪在CCA做一小切口，將事先制備好的尼龍線栓通過此小口插入CCA，松開動脈夾，使線栓經CCA插入到ICA，并順ICA推進（18～22）mm，稍遇阻力即止，即可造成大腦中動脈血流阻斷，結扎ICA固定栓線，縫合皮膚。手術結束后每只大鼠給予4×105U青霉素腹腔注射防止感染。動物清醒后2h進行神經功能學評分（依據Longa評分標準），1分～3分納入標準。

1.3 給藥方法 各組造模前給藥3d，第4天給藥30min后開始造模，造模后給藥觀察至第7天。尼莫地平片1.08mg／100（g·d），腦得生組48.6mg／（100g·d），片仔癀大劑量組48.6 mg／100（g·d），片仔癀中劑量組16.2mg／（100g·d），片仔癀小劑量組5.4mg／100（g·d）。模型組和正常組每天注射等體積的生理鹽水，各組均每日給藥一次，每2天稱一次體重，重新計算每只動物的給藥量，直到取材當日。

1.4 取材與制片 各組大鼠行為學觀察之后，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，斷頭取腦，留取梗死側大腦皮層。將腦組織置于10%的甲醛溶液中24h，常規脫蠟、浸蠟、包埋，制成切片放在載玻片上，常溫保存。

1.5 免疫組織化學染色 采用PV兩步法，切片經二甲苯、梯度酒精常規脫蠟至水；去離子水沖洗5min，0.01mol／LPBS（pH 7.4）沖洗5min；0.01mol／L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中微波熱修復15min；恢復室溫后0.01mol／L PBS（pH 7.4）沖洗3 min×3次；3%過氧化氫（H2O2）室溫避光孵育15min阻斷內源性過氧化物酶活性；0.01mol／L PBS（pH 7.4）沖洗3min×6次；滴加一抗AQP4（兔抗大鼠，1∶50），4℃冰箱過夜（不少于16h）；第二天恢復室溫后0.01mol／L PBS（pH 7.4）沖洗3min×6次；滴加 HRP標記二抗，37℃孵育30min；0.01mol／L PBS（pH 7.4）沖洗3min×3；滴加新鮮配制的DAB顯色試劑，避光顯色，自來水終止顯色；常規升梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；顯微鏡觀察。

1.6 統計學處理 將已經染好的切片置于顯微鏡下，于梗死周邊區隨機選取5個視野，采用SPOT-Ⅱ數碼成像系統、Meta-Morph圖像分析系統計算AQP4的陽性信號光密度值。用SPSS 13.0統計。數據經正態分布及方差齊性檢驗后進行單因素方差分析，結果用均數±標準差（x±s）表示。

2 結 果

AQP4主要表達于星形膠質細胞、腦表面的軟腦膜、腦室系統的室管膜、脈絡叢、下丘腦的視上核和室旁核。AQP4免疫陽性細胞主要分布于梗死周邊區。腦缺血后AQP4表達明顯升高。與假手術組比較，片仔癀各劑量組表達有所升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組表達均顯著下降（P＜0.05）。片仔癀各劑量組較尼莫組、腦得生組表達有所下降（P＜0.05）。片仔癀各劑量組之間無統計學意義，中劑量組較大劑量組、小劑量組表達降低。詳見表1。

表1 各組大腦皮層梗死周邊區AQP4表達（x±s）

3 討 論

中樞神經系統的正常功能與水液的代謝有著極為密切的關系。腦缺血缺氧發生后，腦水腫的發生給該病的預后帶來了極為不良的影響。目前腦水腫就其發病機制而言可分為四種：包括血管源性腦水腫、細胞毒性腦水腫、間質性水腫和滲透壓性腦水腫［1］。而缺血性腦血管病所導致的腦水腫以細胞毒性水腫為主，疾病后期亦包括血管源性水腫。

人們最先認識到水液代謝是以簡單擴散的形式來完成跨膜轉運的，直到1988年人們偶然發現了一種具有選擇性水通透功能的蛋白，并于1997年將該蛋白正式命名為水通道蛋白。目前已發現13種水通道蛋白家族成員（AQP0～AQP12）［2］，其中有6種分布于中樞神經系統。AQP4于1994年被發現，其廣泛分布于中樞神經系統、呼吸系統、消化系統及泌尿系統等，具有廣泛調節水液代謝的作用［3］。是腦組織中含量最多、分布最廣泛、發現最早的汞不敏感性蛋白［4］，其在腦內主要分布于中樞膠質界膜、室管膜等及腦表面的軟腦膜、腦室系統的室管膜、脈絡叢、下丘腦的視上核和腦微血管等腦-腦脊液和血-腦脊液的接觸面上［5］。AQP4在星形膠質細胞極化表達，其在靠近蛛網膜下腔、血管周圍的細胞表面及其終足緊密包繞毛細血管壁形成的膠質界膜上表達明顯，猜測其構成了血腦屏障的第二道隔膜，從而起到調節水液代謝的作用［6］。AQP4為處于持續開放狀態的膜通道蛋白，除水之外不轉運其他小分子物質，可通過神經內分泌系統調控體內及中樞神經系統的水液代謝，與腦水腫的形成和消退關系密切［7］。且該蛋白具有高度快速轉運水的能力，比其他水通道蛋白對水的通透性高3倍～4倍 ，故而在體內水液代謝過程中發揮著不可替代的作用。

AQP4在不同機制的腦水腫中所發揮的作用是不同的。血管源性腦水腫中水液進入腦組織并不依賴于AQP4，而需要其幫助清除過多的水液。水腫的吸收途徑有以下三種：蛛網膜下隙、腦室和血管內［8］。而細胞毒性腦水腫中，細胞外的水分經高表達的AQP4進入細胞內而形成水腫。本實驗結果與其作用機制相吻合。目前在分子、基因水平上對于水液在細胞內、外的運轉以及調控機制尚不完全了解，對于AQP4的作用機制及生物特性尚未完全知曉，有待于進一步探索。

中醫認為陰陽失調，氣血逆亂，上沖于腦則發為中風。血脈不通必然引起水液代謝失常，水液停聚腦竅則神昏，神機失用。目前常用的治療方法包括活血化瘀、醒腦開竅等。片仔癀為國寶名藥，其已公開的中藥成分為牛黃、三七、蛇膽、天然麝香等多種天然名貴藥材，具有清熱解毒、涼血化瘀、消腫止痛之功效。麝香辛溫，開竅醒神，李時珍的《本草綱目》謂其可“通諸竅之不利，開經絡之壅遏”，是治療腦病和其他危重疾病的常用藥物［9］。三七的主要成分為三七皂苷，具有活血化瘀、活絡通脈的作用，可增加腦血流量，擴張血管，改善微循環，抑制血小板聚集，降低血黏度，可有效改善梗死灶的供血狀況并抑制其形成［10］。牛黃歸心、肝經，具有化痰開竅，涼肝熄風，清熱解毒的功效，具有抗炎、止血、降血脂的作用。蛇膽為蛇干燥的膽囊，具有清肺化痰鎮痙、清熱解毒、清肝明目、搜風袪濕的功效［11］。片仔癀在已有的研究中，其藥理作用包括鎮痛、抗炎、利膽、保肝、抗乙肝病毒及免疫調節作用。該藥在缺血性腦血管病領域尚未有研究報道。本研究結果表明，片仔癀可通過抑制局灶性腦梗死大鼠大腦皮層梗死周邊區AQP4的表達，在一定程度上起到減輕腦水腫、保護血腦屏障的作用。但該中藥調節AOP4表達的具體作用機制尚不明了，需進一步研究，以期更好的應用于臨床，發揮切實療效。

參看文獻：

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