急性髓系白血病患者SALL4基因的甲基化改變及其臨床意義

焦夕琴，陳芹，林江*，楊靜，陳星星，湯琴，錢震，馬吉春

(1.江蘇大學附屬金壇醫院檢驗科，江蘇金壇213200;2.江蘇大學附屬人民醫院中心實驗室，江蘇 鎮江212002;3.江蘇大學附屬人民醫院血液科，江蘇鎮江212002;4.江蘇大學附屬金壇醫院血液科，江蘇金壇213200)

婆羅雙樹樣基因4(Sal-like 4，SALL4)是果蠅婆羅雙樹基因spalt的同源基因SALL家族成員，編碼蛋白是1個含有8個鋅指基序的轉錄因子，是維持胚胎干細胞多潛能分化和自我更新及增強造血干細胞自我更新的重要調控基因［1－2］。近年來研究發現，SALL4基因在造血系統腫瘤［急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)、慢性髓系白血病、B細胞急性淋巴細胞白血?。荨⑸臣毎[瘤和肝樣胃癌中表達增高，可能與這些疾病的發生發展相關［3－7］。但SALL4基因高表達的機制至今還未清楚。鑒于DNA甲基化對基因表達的可能調控作用，并且罕見AML患者中SALL4基因啟動子的甲基化狀況報道，我們建立了甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MSP)技術對AML患者SALL4基因啟動子甲基化狀態進行檢測并評價其臨床意義。

1 對象與方法

1.1 病例

45例初診原發AML患者，其中男29例，女16例，年齡15～86歲(中位年齡56歲)，所有患者依據2008年世界衛生組織AML分型標準［8］進行診斷、分型，均經細胞形態學、免疫學、染色體和(或)融合基因檢測證實。其中AML伴t(8;21)4例、AML伴t(15;17)9例、AML不成熟型7例、AML成熟型9例、急性粒-單核細胞白血病13例、急性原始單核細胞白血病和急性單核細胞白血病2例、急性紅白血病1例。另以20例缺鐵性貧血患者的骨髓mRNA和基因組DNA作為對照。

1.2 細胞系

5 種人白血病細胞株(HL60、HEL、NB4、THP1和U937)以1×106/mL的密度置于細胞培養瓶中，加入5 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，置于含5%CO2的細胞培養箱中。于指數生長期收獲細胞提取總RNA和基因組DNA。

1.3 主要試劑和儀器

參見文獻［9］。

1.4 骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cell，BMNC)分離和基因組DNA制備

全部受試者于骨髓穿刺時取骨髓10 mL，肝素抗凝，Ficoll密度梯度離心法分離BMNC?；蚪MDNA提取按試劑盒說明書操作，經紫外分光光度儀定量后置于－20℃保存備用。

1.5 DNA亞硫酸氫鹽修飾

每例取DNA標本1 μg，按DNA甲基化修飾試劑盒操作步驟進行亞硫酸氫鹽修飾處理，－80℃保存備用。

1.6 總RNA提取、反轉錄及SALL4表達檢測

總RNA提取方法、反轉錄體系、反應條件和檢測SALL4表達的RQ-PCR引物、反應體系及反應條件見文獻［6］。

1.7 SALL4基因啟動子MSP檢測

SALL4基因甲基化(M)上游引物:5'-CGTATTTTCGGGTTTGTCGC-3'，下 游 引 物:5'-TTTCTACCCGAACTACGCCG-3';未甲基化(U)上游引物:5'-TTTGTATTTTTGGGTTTGTTGT-3'，下游引物:5'-CTTTTCTACCCAAACTACACCA-3'。熱啟動PCR反應體系為25 μL，包括10 ×PCR 緩沖液、2.5 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTP、上下游引物各 0.4 μmol/L、1 U熱啟動Taq DNA酶及修飾后的樣本DNA 2 μL。MSP反應條件經梯度PCR儀優化，為95℃預變性5 min，然后94℃ 30 s。退火溫度:甲基化為63℃ 30 s、未甲基化為59℃ 30 s，然后72℃延伸30 s，擴增40個循環，最后72℃延伸7 min。未甲基化和甲基化陽性對照分別為經亞硫酸氫鹽修飾的正常人胎盤DNA和亞硫酸氫鹽修飾的人白血病K562細胞株DNA，去離子水作為陰性對照。擴增產物在2%瓊脂糖凝膠上采用100 V電壓電泳1 h，在Gene Genius凝膠成像儀下觀察電泳結果。

1.8 MSP特異性、敏感性及重復性檢測

K562細胞和正常人胎盤DNA分別經測序后鑒定為SALL4完全甲基化和完全未甲基化。應用MSP甲基化和未甲基化反應體系分別對硫化和未硫化的K562細胞DNA標本、胎盤DNA標本及雙蒸水進行檢測，確定MSP特異性。取80 ng經亞硫酸氫鹽修飾的正常人胎盤DNA，應用經亞硫酸氫鹽修飾后的K562細胞DNA進行梯度稀釋后行未甲基化MSP檢測，即未甲基化陽性對照經甲基化陽性對照進行梯度稀釋以確定未甲基化MSP方法的敏感性。同時對1例正常人胎盤DNA標本進行亞硫酸氫鹽修飾后分裝，將其在同一批次MSP未甲基化檢測中重復3次，2%瓊脂糖凝膠電泳并拍照;將剩余的陽性DNA置于－20℃凍存，每3天進行一次未甲基化檢測，2%瓊脂糖凝膠電泳并拍照，比較1個月內條帶亮度是否有明顯變化。

1.9 PCR產物克隆測序

用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒對PCR陽性產物進行純化回收，將其克隆入pMD?19T克隆載體，對感受態大腸埃希菌DH5α進行轉化和藍白斑篩選，挑選白色菌落進行PCR擴增鑒定，將PCR擴增為陽性結果的甲基化和未甲基化產物送上海生工生物技術有限公司測序。

1.10 細胞遺傳學檢查

將患者初診時采集的骨髓細胞采用直接法和24 h短期培養法制備染色體標本，然后進行R顯帶處理。按《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN)》進行核型分析。根據患者預后情況將染色體分為3組:低危組［t(15;17)、t(8;21)、t(16;16)等］、中危組［正常核型、t(9;11)、9q－、11q－、－Y、+21、+8等］、高危組［復雜核型、11q23重排、t(9;22)、5q－、－5、－7、7q－等］［10］。

1.11 統計學分析

應用SPSS 17.0軟件對MSP結果進行統計。分類變量之間差異的比較采用Pearson卡方檢驗或Fisher確切概率法;連續性變量之間差異分析采用Mann-Whitney U檢驗。所有分析均設定P值為雙側分布，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MSP 測序結果

SALL4甲基化和未甲基化陽性產物測序結果見圖1。甲基化產物中所有胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸(CpG)中的胞嘧啶保持不變，而CpG以外的胞嘧啶均轉變為胸腺嘧啶;未甲基化產物中的胞嘧啶全部轉變為胸腺嘧啶。

圖11 例AML患者SALL4基因甲基化特異性PCR陽性產物測序結果

2.2 MSP特異性、敏感性及重復性

硫化修飾后的K562細胞DNA顯示為甲基化條帶，而無未甲基化條帶;硫化后的胎盤DNA顯示未甲基化條帶，而無甲基化條帶;未硫化的K562細胞DNA和胎盤DNA及雙蒸水甲基化和未甲基化結果均為陰性，說明我們建立的MSP方法具有良好的特異性。未甲基化陽性對照用甲基化陽性對照進行梯度稀釋后，SALL4未甲基化檢測的最大靈敏度達1∶50(2%)。見圖2。同一批次MSP未甲基化檢測中3次結果及每3天對凍存標本進行一次未甲基化檢測的重復性良好，1個月內條帶亮度無明顯變化。

圖2 SALL4啟動子未甲基化陽性模板倍比稀釋結果

2.3 AML患者SALL4基因低甲基化頻率

5種白血病細胞株 HL60、HEL、NB4、THP1 和U937均呈不同程度的SALL4低甲基化，其MSP結果見圖3。典型的患者標本MSP檢測結果見圖4。

圖3 5種白血病細胞株甲基化特異性PCR產物

圖4 AML患者MSP產物電泳結果

20例缺鐵性貧血標本均為甲基化MSP產物陽性、低甲基化MSP產物陰性，低甲基化陽性率為0%(0/20);45例AML標本均為甲基化MSP產物陽性，其中9例呈低甲基化產物陽性，低甲基化陽性率為20.0%(9/45)，與對照組差異具有統計學意義(P＜0.05)。統計學分析揭示SALL4基因低甲基化改變與患者的年齡、性別、血紅蛋白、血小板計數等結果均無相關性(P＞0.05)，但與患者的白細胞計數顯著相關，低甲基化患者的白細胞水平明顯高于甲基化患者(P=0.027)。見表1。

2.4 AML患者中SALL4低甲基化與SALL4表達的相關性

我們檢測了23例AML患者的mRNA SALL4表達水平，SALL4表達水平和SALL4低甲基化明顯相關，低甲基化患者(3例)的SALL4表達水平明顯高于甲基化患者(20例，P＜0.05，表1)。5種白血病細胞株均呈SALL4陽性表達［6］，與本研究檢測的細胞株SALL4低甲基化陽性結果相符。

2.5 SALL4低甲基化改變與AML亞型的關系

AML患者WHO分型中，不同亞型的患者間SALL4低甲基化頻率不同，但7類亞型間差異并無統計學意義(P ＞0.05，表1)。

2.6 SALL4低甲基化改變與染色體核型的關系

33例患者獲得染色體核型資料，其中，核型異常者占57.6%(19/33)。2例SALL4低甲基化陽性患者染色體分析失敗，其余7例低甲基化陽性患者均見于中危和高?；颊?，低?；颊呔匆奡ALL4低甲基化，兩組差異具有統計學意義(P＜0.05，表1)。

表1 SALL4甲基化狀態與AML患者臨床特征的相關性

3 討論

DNA甲基化是細胞的一種表觀遺傳現象，在細胞分化、發育及增殖過程中起著十分重要的作用。DNA的異常甲基化與腫瘤的發生發展密切相關，低甲基化改變是腫瘤形成過程中的一個特征性表觀遺傳學改變［11］。近年來，DNA甲基化已經在腫瘤發生學領域得到廣泛研究，尤其是在腫瘤的早期診斷、分級分類、疾病監測及預后評估中的潛在價值受到越來越多的關注。

本研究建立了SALL4基因啟動子甲基化檢測的MSP技術，該方法經證明具有良好的特異性、敏感性和重復性，并且對1例隨機選取的陽性標本測序證明其序列是正確的，保證了結果的可靠性，這些充分說明我們建立的MSP技術可用于臨床標本SALL4基因啟動子甲基化狀態的檢測。本研究對45例AML患者標本進行檢測，證實初發AML患者中存在SALL4基因啟動子低甲基化，其陽性率為20.0%，與對照組間的差異具有統計學意義(P＜0.05)，揭示 SALL4啟動子低甲基化改變可能與AML發病相關。

AML患者及白血病細胞株中SALL4基因啟動子低甲基化和SALL4基因高表達相關，提示該基因啟動子甲基化狀態是調控該基因表達的一個機制。5-氮雜胞苷和5-氮雜-2'-脫氧胞苷是兩種強有力的DNA去甲基化藥物，現已用于治療骨髓增生異常綜合征和AML。但是，這類藥物的弊端在于可以激活沉默的癌基因，使之表達，導致腫瘤的生長［11－12］。近期一項研究發現，SALL4基因可以通過調節ATP結合盒轉運基因和維持側群細胞的數量而產生耐藥作用［13］，故AML患者中SALL4基因能否被激活還需要通過對DNA去甲基化藥物的臨床應用加以確定。

AML患者中SALL4啟動子低甲基化和患者的核型危險分級相關。SALL4低甲基化只出現在中危和高危患者中，未出現于t(8;21)或t(15;17)這類預后良好的核型患者中，提示SALL4基因啟動子低甲基化改變可能與AML患者預后相關。

我們的研究結果還表明，AML患者中SALL4低甲基化與高水平的白細胞計數相關，這點可能反映SALL4基因在控制白血病細胞的增殖中起作用。

綜上所述，SALL4低甲基化是AML患者中一個常見分子事件，可能與AML患者中高危核型相關。

［1］ Zhang J，Tam WL，Tong GQ，et a1.Sall4 modulates embryonic stem cell pluripotency and early embryonic development by the transcriptional regulation of Pou5f1［J］.Nat Cell Biol，2006，8(10):1114 －1123.

［2］ Yang J，Aguila JR，Alipio Z，et a1.Enhanced self-renewal of hematopoietic stem/progenitor cells mediated by the stem cell gene Sall4［J］.J Hematol Oncol，2011，4:38.

［3］ Ma Y，Cui W，Yang J，et al.SALL4，a novel oncogene，is constitutively expressed in human acute myeloid leukemia(AML)and induces AML intransgenic mice［J］.Blood，2006，108(8):2726 －2735.

［4］ Cui W，Kong NR，Ma Y，et a1.Differential expression of the novel oncogene，SALL4，in lymphoma，plasma cell myeloma，and acute lymphoblastic leukemia［J］.Mod Pathol，2006，19(20):1585 －1592.

［5］ 郭野，崔巍，崔京濤，等.急性髓細胞白血病中婆羅雙樹樣基因4的表達及其臨床意義［J］.中華檢驗醫學雜志，2009，32(1):25－29.

［6］ 陳芹，錢軍，林江，等.急性和慢性髓系白血病患者SALL4基因的表達［J］.中國實驗血液學雜志，2013，21(2):315－319.

［7］ 林江，紀潤璧，錢軍.轉錄因子婆羅雙樹樣基因4(SALL4)研究進展［J］.中國實驗血液學雜志，2011，19(3):820－823.

［8］ Swerdlow SH，Campo E，Harris NL，et al.WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues in 2008［M］.Lyon，France:IARC Press，2008.

［9］ 李云，錢軍，陳芹，等.慢性髓系白血病PDLIM4基因表達與其啟動子甲基化水平的關系［J］.江蘇大學學報:醫學版，2013，23(1):17－21，25.

［10］ Slovak ML，Kopecky KJ，Cassileth PA，et al.Karyotypic analysis predicts outcome of preremission and postremission therapy in adult acute myeloid leukemia:a SouthwestOncology Group/Eastern Cooperative Oncology Group Study［J］.Blood，2000，96(13):4075 －4083.

［11］ Esteller M.Epigenetics in cancer［J］.N Engl J Med，2008，358(11):1148 －1159.

［12］ Kelly TK，De Carvalho DD，Jones PA.Epigenetic modifications as therapeutic targets［J］.Nat Biotechnol，2010，28(10):1069 －1078.

［13］ Jeong HW，Cui W，Yang Y，et al.SALL4，a stem cell factor，affects the side population by regulation of the ATP-binding cassette drug transport genes［J］.PLoS One，2011，6(4):e18372.