糖尿病心肌病小鼠心肌成纖維細胞miR-375表達及其對膠原蛋白Ⅰ合成的影響

黃燕，張贏予，王好，周艷芳，張國輝，芮濤

(江蘇大學附屬人民醫院心內科，江蘇鎮江212002)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的常見并發癥，其臨床診斷是基于糖尿病患者獨立于冠心病、高血壓和乙醇性心肌病等出現心功能不全［1］。心肌纖維化是糖尿病心肌病發生發展過程中共同的、標志性的病理特征。心肌纖維化主要是心肌成纖維細胞合成細胞外基質蛋白增加，如Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ)，Ⅲ型膠原蛋白(collagen Ⅲ)［2］。微小RNA(microRNA)是由18～24個核苷酸組成的非編碼的小分子RNA，通過與靶mRNA的3'-UTR區域的互補配對結合而抑制靶mRNA的翻譯或促進該mRNA的降解從而降低目標蛋白的表達，進而發揮其生物學功能［3］。以往研究表明，miR-375直接調節胰腺β細胞胰島素的分泌，其表達與糖尿病的形成密切相關［4］。本研究旨在檢測糖尿病狀態下心肌成纖維細胞中miR-375的表達，同時探討miR-375在糖尿病心肌纖維化中的可能作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物和主要試劑

C57BL/6小鼠，2～4周齡，雌雄不限，由江蘇大學動物實驗中心提供。DMEM(高糖及低糖)購自美國Gibco公司;標準小牛血清購自美國Hyclone公司，胰酶購自美國Sigma公司;細胞RNA提取試劑盒，RNA反轉錄試劑盒，實時熒光定量 PCR試劑盒，小鼠 miR-375引物，RNU6B購自QIAGEN公司;小鼠miR375抑制劑(熒光素標記)購自上海吉瑪制藥技術有限公司;轉染試劑，無血清培養基購自Invitrogen公司;免疫組化試劑盒購自北京厚德生物科技有限公司;波形蛋白(vimentin)一抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌成纖維細胞的分離、培養及傳代脫頸法處死C57BL/6小鼠，75%乙醇消毒2次，無菌條件下取出心臟，將其剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的組織塊，用無Ca2+-Mg2+的Hank's緩沖液清洗組織塊，0.08%胰酶加0.06%膠原酶37℃水浴消化，收集消化后的上清并用含20%血清的低糖(5 mmol/L)DMEM中和，直至組織塊變透明終止消化。將收集的細胞離心重懸，接種至10 cm2細胞培養皿，37℃ 5%CO2培養箱內培養2 h，差速貼壁法除去未貼壁的其他細胞，用含10%小牛血清的低糖DMEM培養基培養心肌成纖維細胞。當細胞長滿至培養皿的70%～80%時，用0.25%胰酶消化按1∶2的比例進行傳代。

1.2.2 心肌成纖維細胞形態學觀察及鑒定 倒置顯微鏡下觀察第2代心肌成纖維細胞的形態。取第2代的心肌成纖維細胞采用免疫組化法進行波形蛋白鑒定，波形蛋白陽性率作為心肌成纖維細胞純度鑒定的指標，陰性對照用PBS代替一抗。400倍顯微鏡下隨機選取5個視野計數20～30個細胞，計算波形蛋白陽性細胞的比例。

1.2.3 實時定量PCR檢測心肌成纖維細胞中miR-375的表達 心肌成纖維細胞分為2組，即對照組和高糖處理組，對照組采用5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養，高糖處理組采用25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養。利用細胞RNA提取試劑盒提取總RNA，DEPC水溶解獲得的RNA，核酸蛋白分析儀(Beckman Coulter，USA)檢測 RNA濃度及純度;RNA反轉錄試劑盒將細胞總RNA反轉錄成cDNA;構建miR-375和RNU6B的實時定量PCR反應體系(20 μL):實時定量PCR 混合試劑10 μL、通用引物2 μL、去核糖核酸酶水 4 μL、小鼠 miR-375 引物2 μL、cDNA 模板2 μL;反應條件:95 ℃變性15 min，94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s，共 40 個循環，每個樣本均作復管PCR反應，至少重復2次(實時定量PCR儀采用Bio-rad CFX96)。采用RNU6B作為內參照，用RNU6B的拷貝數作為校正基數，通過Light Cycler軟件直接獲得各個樣本中miR-375的ΔCt值;以對照組的 ΔCt值作為校正，得出 － ΔΔCt，按目的基因表達量 =2－ΔΔCt公式計算各個樣本中miR-375的相對表達量。

1.2.4 miR-375抑制劑轉染心肌成纖維細胞 在37℃、5%CO2孵育箱中，以含10%胎牛血清的高糖DMEM培養心肌成纖維細胞。轉染前以胰酶消化心肌成纖維細胞，計數后，以105/mL接種于6孔板中，待細胞的融合率達到80%左右時，換為不含血清的高糖DMEM培養液，饑餓細胞6 h，按照說明書轉染細胞，陰性對照組轉染miR-375抑制劑陰性對照。轉染6 h后，換為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液，培養48 h后采用實時定量PCR方法檢測細胞轉染效率。

1.2.5 免疫組化檢測各組心肌成纖維細胞Ⅰ型膠原蛋白的表達 心肌成纖維細胞按105/mL接種于置有無菌蓋玻片的6孔板內進行細胞爬片，細胞貼壁后，用高糖培養基處理6 h，瞬時轉染miR-375抑制劑;轉染48 h后采用免疫組化試劑盒檢測Ⅰ型膠原蛋白的表達。操作步驟:PBS漂洗，3%H2O2-甲醛處理，PBS漂洗，血清封閉，一抗(1∶200，PBS稀釋)孵育過夜，PBS漂洗，二抗孵育，PBS漂洗，SABC孵育，PBS漂洗，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木青復染，自來水沖洗，脫水、透明、封片、鏡檢。陰性對照用PBS代替一抗。200倍顯微鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數20～30個細胞，計算Ⅰ型膠原蛋白陽性細胞的比例。

1.3 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件進行分析。數據采用均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 C57BL/6小鼠心肌成纖維細胞形態學觀察及純度鑒定

在倒置顯微鏡下觀察，心肌成纖維細胞呈梭形，多角形，細胞質透明，細胞核大，呈橢圓形，常含有2～3個核。培養第2代的心肌成纖維細胞波形蛋白鑒定，心肌成纖維細胞胞質呈棕黃色，即表達陽性，非心肌成纖維細胞表達陰性，結果顯示心肌成纖維細胞純度達90%。見圖1。

圖1 免疫組化染色鑒定心肌成纖維細胞純度(×400)Fig 1 The purity of cardiac fibroblasts evaluated by immunohistochemical staining with vimentin

2.2 高糖對心肌成纖維細胞中miR-375表達的影響

實時定量PCR方法檢測結果顯示，心肌成纖維細胞經高糖處理6，12，24 h后，miR-375表達增加(F=91.263，P＜0.05)，均顯著高于對照組(P均＜0.05)，見圖2。

圖2 實時定量PCR檢測miR-375的差異性表達Fig 2 The different expression of miR-375 in cardiac fibroblasts detected by qRT-PCR

2.3 miR-375抑制劑的轉染效率

熒光實時定量PCR檢測結果顯示，miR-375抑制劑轉染心肌成纖維細胞的效率約70%，見圖3。心肌成纖維細胞轉染48 h后用于實驗。

圖3 實時定量PCR檢測miR-375抑制劑轉染效率Fig 3 The transfection efficiency of miR-375 inhibitor detected by qRT-PCR

2.4 miR-37抑制劑對高糖處理心肌成纖維細胞中Ⅰ型膠原蛋白表達的影響

免疫組化Ⅰ型膠原蛋白陽性心肌成纖維細胞胞質呈棕褐色。Ⅰ型膠原蛋白陽性率=Ⅰ型膠原蛋白陽性細胞數/總細胞數×100%。免疫組化結果表明，miR-375抑制劑組的心肌成纖維細胞Ⅰ型膠原蛋白陽性表達率(37.84±3.34)%顯著低于miR-375抑制劑陰性對照組的(76.20±6.96)%，差異有統計學意義(t=5.346，P ＜0.05)。見圖4。

圖4 免疫組化染色檢測心肌成纖維細胞中Ⅰ型膠原蛋白的表達(×200)Fig 4 Expression of collagenⅠin cardiac fibroblasts evaluated by immunohistochemical staining

3 討論

糖尿病心肌病是糖尿病的常見并發癥之一，也是導致糖尿病患者致殘率和致死率較高的主要原因。其發病機制至今未明，對該病的治療仍缺乏有效手段。心肌纖維化是糖尿病心肌病的病理性改變之一。心肌纖維化是心肌成纖維細胞合成細胞外基質蛋白，如Ⅰ型膠原蛋白﹑Ⅲ型膠原蛋白等增加，進而在心肌細胞間隙沉積，導致心室壁僵硬，順應性下降，影響心室的舒張和收縮功能，最終導致心力衰竭，甚至死亡。近年來，在探索心肌纖維化發生機制的過程中，微小RNA的作用引人關注。微小RNA是一類非編碼的小分子RNA，通過與靶mRNA特異性以堿基互補配對的方式結合，促進靶mRNA的降解或抑制該mRNA的翻譯而發揮其生物學功能［3］。微小RNA在許多生物學過程中發揮重要的調控作用，如細胞增殖、分化、凋亡、癌癥發生等。最近研究表明，微小RNA也參與調控心血管系統的發育和疾病發生過程。目前已經證明miR-133和miR-30通過靶向作用于結締組織生長因子，一種關鍵的促纖維化蛋白，而參與心肌纖維化的形成［5］。另外，也已證明在冠狀動脈結扎的心肌梗死小鼠模型中miR-29的表達下降與膠原蛋白的表達增加相關，所以被認為參與心肌纖維化［6］。Feng等［7］發現糖尿病心肌 miR-133表達下降導致糖尿病小鼠心肌肥厚。

本課題組前期通過微陣基因序列檢測分析，發現糖尿病小鼠的心肌有多個微小RNA的表達上調，其中包括 miR-375，miR-99a，miR-133a等。miR-375最初被發現在胰腺胰島中表達，調節胰島素的分泌和葡萄糖的代謝［8］，影響胰腺α和β細胞的質量并參與胰腺癌的發展［8－10］。最近報道 miR-375與腫瘤的發展有關，其在一些惡性腫瘤中表達下調如肝癌、胃 癌［11－13］，頭 頸 部 鱗 狀 細 胞 癌［14－15］、胰 腺癌［16］。但到目前為止，miR-375調節糖尿病心肌纖維化相關的蛋白表達，參與糖尿病心肌纖維化的發生和發展尚未見文獻報道。

本實驗通過體外培養C57BL/6小鼠的心肌成纖維細胞經高糖處理制成DCM模型，發現心肌成纖維細胞經高糖處理6，12，24 h后，miR-375的表達均顯著增加，這一研究結果表明糖尿病高血糖影響心肌成纖維細胞miR-375的表達;另外，高糖處理的心肌成纖維細胞在轉染miR-375抑制劑抑制miR-375表達后，胞質中Ⅰ型膠原蛋白的表達顯著降低，這提示，miR-375在糖尿病心肌纖維化中起一定的作用，其具體的作用機制尚不清楚?；谏镄畔⒐ぞ?，miR-375靶向作用于IL-33的3'-UTR，而新近研究報道IL-33具有抗纖維化的作用。因此，我們推測miR-375可能通過靶向作用于IL-33參與糖尿病心肌纖維化的發生發展。為研究miR-375在糖尿病心肌病心肌纖維化中的確切機制，需明確高血糖是否能導致心肌成纖維細胞IL-33的表達下調從而促進心肌纖維化的發生，以及IL-33mRNA 3-UTR是否為miR-375的靶標。

本研究結果提示miR-375在糖尿病心肌纖維化中起一定的作用，為探討糖尿病心肌病心肌纖維化發病機制提供了新的線索，對糖尿病心肌病心肌纖維化的治療提供了新的理論依據。

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