高效液相色譜質譜聯用儀分析不同產地蜂膠的多酚類成分（續）

羅照明 張紅城 （譯）

（中國農業科學院蜜蜂研究所，北京100093）

（接2013年《中國蜂業》上旬第1期）

不同地區蜂膠的290nm的HPLC色譜圖如圖2所示。來自于南美洲的蜂膠（A）和歐洲的蜂膠（C）的化學成分相近，而與大部分的巴西蜂膠差別明顯。歐洲蜂膠的特點是含有大量的酚酸 （表 2，峰 1－5，9，19，22a－24，31－34，36，43，44）和黃酮（ 表 2,峰 6－8，10－18，20－22，25－30，35，37－42）。很多的化學成分也出現在亞洲蜂膠（如中國）和阿根廷蜂膠。相比之下，巴西蜂膠有明顯的模式。在綠色蜂膠和Silvestre蜂膠中的阿替匹林C（峰53）、P-香豆酸的異戊二烯衍生物（峰56）及不同的咖啡酰奎尼酸（表2，峰45－48）是主要的成分，其中還含有少量的4-羥基-3-異戊二烯肉桂酸、異平基-P-香豆酸酯（峰50），山奈素（峰52），一個肉桂酸的衍生物（峰 54），一個色滿（chroman）衍生物（峰55）及一個香豆酮衍生物（峰57）。在巴西紅蜂膠里檢測出的少量的黃酮，有總含量少于0.2%的鷹嘴豆素A（Biochanin A）和芒柄黃花素（Formononetin），還有一些被Piccinelli等報道過的異黃酮。

蜂膠里大部分化合物是通過與標準品的色譜保留時間和紫外光譜對照來進行確認的。沒有標準品的未知成分，通過色譜聯合的紫外數據及質譜進行確認。色譜法和紫外光譜能夠保證區分不同級別的多酚。事實上，在反相色譜的條件下，由于羥基化和甲基化的位置及數量不同，不同的黃酮被分離開來。羥基數量的增加會降低保留時間，而除了甲基在C5位置，甲基化數量的增加會增加保留時間。而且，烷酮醇（如短葉松素），黃酮（柯因），黃烷酮（如松屬素）比相應的黃酮醇（如高良姜素）先洗脫出來。

考慮到紫外光譜特征，肉桂酸衍生物典型的最大紫外吸收峰在275～325nm范圍。相比之下，黃酮醇和黃酮最大的紫外吸收峰分別在265/358和268/310nm，這些容易區別，但是烷酮醇（UVmax290 nm）和黃烷酮（UVmax292 nm）不容易辨別。

分子離子峰及一些特殊的離子碎片作為進一步確認未知化合物參考的方法。MS/MS在陰離子模式和陽離子模式進行，因為多酚化合物的每一組離子碎片不同。肉桂酸在陽離子模式下產生離子峰[M－H2O]+，在陰離子模式下產生離子峰[M－COOH]－。然而，肉桂酸酯主要在陰離子模式下產生離子碎片。例如，咖啡酸芐酯（峰 23）產生離子峰[m/z]－179（caffeic acid）[m/z]－161（caffeic acid－H2O）and[m/z]－135（caffeic acid－COOH）。

如果黃酮醇，黃烷酮及黃酮在A環上沒有取代基，就會產生陰離子峰[m/z]－151和陽離子峰[m/z]+153。不同的黃酮類都會有一個共同的離子峰[m/z]－151，它來源于A環的逆狄爾斯-阿爾德反應。但是黃酮醇的離子峰不同，如短葉松素。它們產生一個離子峰[m/z]－253[M－H2O]－，H2O的缺失是因為C環上C3位置存在羥基。類似的情況，5-甲氧基短葉松素乙酸酯（峰18）在低能量碰撞下產生離子峰[m/z]－285[M－acetate]－，[m/z]－267[M－acetate－H2O]－，[m/z]－253[M－acetate－H2O-CH3]－（圖3）。在高的碰撞能量下只產生離子峰[m/z]－253。相似分裂模式也存在于短葉松素的酯類，如短葉松素-3-丙酸酯（圖4，峰35）。峰8需要特別說明，因為它的紫外光譜特征表明其為槲皮素的衍生物，分子離子峰[m/z]－315也說明其為一個甲氧基槲皮素。這個甲氧基的位置不可能在B環上的C3'，事實上，3'-甲氧基槲皮素就是異鼠李素，它的保留時間與峰8不同。另一方面甲氧基不能在A環，因為MS/MS產生一個離子峰[m/z]－151，從而排除了甲氧基的這個位置。因此，峰8只能為3-甲氧基槲皮素（甲氧基位于C環C3位置），基于紫外光譜特征，結合分子離子峰[m/z]－299，離子碎片[m/z]－255[M－COOH]－和[m/z]+245[M－CH2COOH]+，峰53可以鑒定為阿替匹林C。通過對紫外光譜特征（典型的P-香豆酸衍生物）及離子碎片[m/z]－187[M－COOH]－和 [m/z]+215[M－H2O]+分析，可以認為峰50是異平基結合到P-香豆酸的一個化合物。

3.4 蜂膠中黃酮和酚酸的含量

不同地區來源的不同蜂膠樣品中的總黃酮和總酚酸含量匯總如表3。通過可以得到的標準品制作標準曲線來測定黃酮和酚酸的含量。短葉松素及其酯類用短葉松素標準曲線進行實驗檢測，它們的含量通過分子量比例來換算。按類似的方法，咖啡酸和P-香豆酸的酯類含量分別用咖啡酸和P-香豆酸標準曲線測定。除了巴西蜂膠的黃酮含量很低之外，大部分地區黃酮含量較高，如柯因 （2～4%），松屬素（2～4%），短葉松素乙酸酯 （1.6～3%）及高良姜素 （1～2%）。單從黃酮含量考慮，黃酮含量低于11%的蜂膠可以認為是次品的；黃酮

含量介于11～14%之間的為可以接受的，黃酮含量介于14～17%，及大于17%可分別認為是好的及高質量的。另一方面，肉桂酸衍生物（如P-香豆酸酯及CAPE）對人的身體健康有著顯著的積極的影響；因此，對于它們的定性和定量具有重要的意義。

表2 不同來源的蜂膠樣品中分離鑒定的化合物及其RT，UV，MS和MS/MS特征

表3 不同地區蜂膠的總黃酮和酚酸的含量（g/100g）

4 總結

不同地區的蜂膠含有不同的化學成分，陰離子模式下的LC-DAD-MS方法是鑒別和篩選蜂膠的有效的指紋識別方法。而且，結合MS和碰撞產生的碎片離子（CID-Ms2）可用于結構的鑒定，特別是沒有標準品的化合物。盡管多酚代表著大多數蜂膠的成分，但本實驗結果表明，黃酮類物質可作為評價蜂膠質量的參考物。

考慮到巴西蜂膠含有的黃酮很少，酚酸類（如artepillin C）可以用于評價其蜂膠的質量。本實驗方法可以考慮應用于蜂膠原料及其作為不同商業用途的篩選。