白念珠菌對(duì)樹突狀細(xì)胞Bcl 10和IL-23表達(dá)的影響①

胡志德 黃元蘭 汪懷周 孫 懿 秦 琴 陳孫孝 鄧安梅

(濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，濟(jì)南250031)

抗原遞呈細(xì)胞上的模式識(shí)別受體(PRR)對(duì)入侵機(jī)體的白念珠菌進(jìn)行感知是免疫系統(tǒng)啟動(dòng)針對(duì)白念珠菌感染的免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)［1］。樹突狀細(xì)胞是目前已知的唯一可以活化初始輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)的專職抗原遞呈細(xì)胞，因而也是連接固有免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答的樞紐［2］。樹突狀細(xì)胞上的Dectin-1是參與白念珠菌的免疫感知的PRR之一，其配體是白念珠菌細(xì)胞壁的主要成分β-1-3葡聚糖［3，4］。當(dāng)Dectin-1被配體活化以后，其胞漿部分的免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)上的酪氨酸被酪氨酸激酶Syk磷酸化，然后迅速募集下游的半胱天冬酶的募集決定蛋白9(CARD9)、Bcl 10和黏膜相關(guān)淋巴瘤轉(zhuǎn)位基因1(MALT1)等分子組成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，最終通過NF-κB啟動(dòng)下游多種炎癥因子、細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，并由此開啟了針對(duì)白念珠菌的免疫應(yīng)答過程［4-8］。此外，最近的研究也發(fā)現(xiàn)Dectin-1的激活還可以通過Raf途徑啟動(dòng)多種細(xì)胞因子的表達(dá)，引發(fā)有別于CARD9-Bcl 10-MALT1的生物學(xué)效應(yīng)［9］。深入研究這些特定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化與生物學(xué)效應(yīng)之間的關(guān)系，有助于我們更加全面和深入地了解白念珠菌感染誘發(fā)的免疫應(yīng)答機(jī)制。

被白念珠菌活化的樹突狀細(xì)胞通過在感染部位及其附近淋巴結(jié)形成局部細(xì)胞因子微環(huán)境而指導(dǎo)初始輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)的分化［10］。在白念珠菌引發(fā)的獲得性免疫應(yīng)答中，各種Th細(xì)胞在功能上彼此配合，相互制約，決定了針對(duì)白念珠菌的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度、類型和持續(xù)時(shí)間［3］。目前已知，Th17細(xì)胞是免疫系統(tǒng)對(duì)抗白念珠菌感染的主要力量之一［11］。在Th17的分化歷程中，IL-23的主要作用是維持細(xì)胞的擴(kuò)增與存活［12］。IL-23敲除的小鼠，對(duì)白念珠菌感染的抵抗力明顯減弱，表明IL-23是免疫系統(tǒng)清除白念珠菌感染不可或缺的力量之一［13］。然而，在白念珠菌活化的樹突狀細(xì)胞中，IL-23的表達(dá)是否與Bcl 10有關(guān)尚不明確。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在白念珠菌刺激的樹突狀細(xì)胞中，Bcl 10表達(dá)逐漸降低，且同時(shí)伴隨著IL-23的表達(dá)降低。我們的結(jié)果初步提示，白念珠菌誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞釋放IL-23可能與Bcl 10有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 白念珠菌的來源與滅活 白念珠菌為第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科真菌實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)(ATCC編號(hào)為H137)，復(fù)蘇后接種沙保氏培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)48小時(shí)后，挑取菌落于生理鹽水洗滌兩遍，之后采用生理鹽水重懸。調(diào)整白念珠菌計(jì)數(shù)為108ml－1，吸取1 ml懸液，置于無菌EP管中，在100℃沸水中滅活1小時(shí)后待用。

1.2 樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng) 抽取空腹健康個(gè)體外周血10 ml，EDTA-K2抗凝，以淋巴細(xì)胞分離液LymphoprepTM(挪威AXIS-SHIELD公司)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。之后以磁珠分離法分離出CD14+細(xì)胞，MACS磁性細(xì)胞分選試劑盒購自美國(guó)Miltenyi biotech公司。校正CD14+細(xì)胞濃度至106ml－1，置于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、200 U/ml的 GM-CSF和100 U/ml的 IL-4(均購自英國(guó)Peprotec公司)的RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)中進(jìn)行培養(yǎng)。并于培養(yǎng)第3、5和7天更換細(xì)胞培養(yǎng)液。在培養(yǎng)第7天后，加入MOI為1∶1的熱滅活白念珠菌進(jìn)行刺激，并在刺激后的不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)Bcl 10以及IL-23的表達(dá)狀況。

1.3 RT-PCR 利用NCBI的引物設(shè)計(jì)和特異性檢驗(yàn)工具Primer-BLAST進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，得到的引物序列如表1。

RNA的反轉(zhuǎn)錄試劑購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄過程參照說明書進(jìn)行。RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果采用2－ΔΔct法表示［14］。

1.4 Western blot 采用超聲破碎法收集細(xì)胞蛋白，98℃熱變性5分鐘預(yù)后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。鼠抗人Bcl 10抗體和內(nèi)參GAPDH抗體購自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.5 ELISA IL-23的 ELISA試劑盒購自 eBioscience公司，ELISA檢測(cè)過程參考說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 兩組資料的比較采用配對(duì)樣本t檢測(cè)，不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)指標(biāo)之間的比較采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析。所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均在SPSS17.0中進(jìn)行，定義 P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 白念珠菌刺激導(dǎo)致單核源性樹突狀細(xì)胞內(nèi)Bcl 10表達(dá)下調(diào) 如圖1A所示，定量PCR結(jié)果表明在接受白念珠菌刺激后，單核源性樹突狀細(xì)胞內(nèi)Bcl 10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸下調(diào)(P＜0.01)。在刺激12小時(shí)后，其相對(duì)表達(dá)量?jī)H相當(dāng)于刺激前的40%左右，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。相比之下，未經(jīng)白念珠菌刺激的單核源性樹突狀細(xì)胞內(nèi)Bcl10 mRNA的表達(dá)則相對(duì)恒定。Western blot結(jié)果表明，Bcl 10在蛋白水平的變化與mRNA基本一致。這些結(jié)果表明，持續(xù)的白念珠菌刺激可以引起單核源性樹突狀細(xì)胞內(nèi)Bcl 10表達(dá)下調(diào)。

表1 RT-PCR的引物Tab.1 Primers for RT-PCR

圖1 熱滅活白念珠菌刺激導(dǎo)致單核源性樹突狀細(xì)胞內(nèi)Bcl 10表達(dá)下調(diào)(n=3)Fig.1 Heat-killed Candida albicans stimulation inhibit Bcl 10 expression in monocyte derived dendritic cells(n=3)

圖2 熱滅活白念珠菌刺激導(dǎo)致單核源性樹突狀細(xì)胞合成和釋放IL-23的動(dòng)態(tài)觀察Fig.2 Kinetics analysis of IL-23 produced and released by heat-killed Candida albicans treated monocyte derived dendritic cells

2.2 熱滅活白念珠菌刺激導(dǎo)致單核源性樹突狀細(xì)胞合成和釋放IL-23的動(dòng)態(tài)觀察 我們同時(shí)分析了白念珠菌刺激對(duì)樹突狀細(xì)胞釋放IL-23的影響。RT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL-23 mRNA的表達(dá)在白念珠菌刺激后迅速增高，但4小時(shí)后mRNA的表達(dá)逐漸降低(圖2A，P均小于0.05)。ELISA法也發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基內(nèi)IL-23的濃度在6小時(shí)以后逐漸進(jìn)入平臺(tái)期(圖2B，P均小于0.01)，提示樹突狀細(xì)胞釋放IL-23的速度在逐漸降低。

3 討論

本研究分析了Bcl 10這一Dectin-1信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用的分子在白念珠菌活化的樹突狀細(xì)胞的表達(dá)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)其在熱滅活白念珠菌刺激后表達(dá)逐漸降低，在刺激4小時(shí)以后降低的趨勢(shì)和幅度更為顯著，提示Dectin-1信號(hào)通路的激活可能會(huì)引發(fā)一種反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，通過抑制Bcl 10的表達(dá)來調(diào)節(jié)Dectin-1信號(hào)的強(qiáng)度。已知Dectin-1信號(hào)通路的活化會(huì)啟動(dòng)多種炎癥因子和趨化因子的表達(dá)，對(duì)Dectin-1信號(hào)通路強(qiáng)度進(jìn)行的調(diào)節(jié)在一定程度上可以局限免疫應(yīng)答的強(qiáng)度、類型和持續(xù)時(shí)間，以保護(hù)機(jī)體免遭失控的免疫應(yīng)答造成的病理損傷。

更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)IL-23 mRNA的表達(dá)也同Bcl 10呈現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，即在白念珠菌刺激4小時(shí)后逐漸降低。培養(yǎng)基內(nèi)IL-23濃度在刺激6小時(shí)以后進(jìn)入平臺(tái)期，提示單核源性樹突狀細(xì)胞釋放IL-23的速度在白念珠菌刺激6小時(shí)以后已經(jīng)逐漸減弱。結(jié)合以往關(guān)于Bcl 10參與Dectin-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究結(jié)論，這些結(jié)果提示熱滅活白念珠菌刺激導(dǎo)致的Bcl 10表達(dá)下調(diào)，可能是引起IL-23表達(dá)逐漸下降的原因。然而，Bcl 10表達(dá)下調(diào)的機(jī)制仍然有待于進(jìn)一步研究。

動(dòng)物研究和臨床研究都相繼證實(shí)，免疫系統(tǒng)對(duì)白念珠菌的識(shí)別依賴于Dectin-1，且Dectin-1信號(hào)通路的活化可以啟動(dòng)IL-23的表達(dá)，在感染部位形成高水平的 IL-23微環(huán)境，促進(jìn)后續(xù)的 Th17反應(yīng)［3，15-17］。然而，Th17 反應(yīng)是雙刃劍，雖然適時(shí)、適量的Th17反應(yīng)有助于病原體的清除，但是失控的Th17反應(yīng)則會(huì)引起機(jī)體的免疫損傷［18，19］。本研究結(jié)果初步提示，在熱滅活白念珠菌刺激的樹突狀細(xì)胞中，Bcl 10可以調(diào)節(jié)IL-23的釋放。我們推測(cè)，Bcl 10調(diào)節(jié)IL-23的釋放可能會(huì)最終改變Th17反應(yīng)的強(qiáng)度，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)機(jī)體免遭免疫損傷的目的。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了白念珠菌刺激的單核源性樹突狀細(xì)胞內(nèi)Bcl 10的表達(dá)逐漸下調(diào)，這可能是導(dǎo)致IL-23表達(dá)下調(diào)的原因之一。Bcl 10表達(dá)下調(diào)可能是免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)Th17反應(yīng)強(qiáng)度的機(jī)制之一。

1 Netea M G，Marodi L.Innate immune mechanisms for recognition and uptake of Candida species［J］.Trends Immunol，2010;31(9):346-353.

2 Steinman R M，Idoyaga J.Features of the dendritic cell lineage［J］.Immunol Rev，2010;234(1):5-17.

3 Romani L.Immunity to fungal infections［J］.Nat Rev Immunol，2011;11(4):275-288.

4 Reid D M，Gow N A，Brown G D.Pattern recognition:recent insights from Dectin-1［J］.Curr Opin Immunol，2009;21(1):30-37.

5 Brown G D.Dectin-1:a signalling non-TLR pattern-recognition receptor［J］.Nat Rev Immunol，2006;6(1):33-43.

6 Skrzypek F，Cenci E，Pietrella D et al.Dectin-1 is required for human dendritic cells to initiate immune response to Candida albicans through Syk activation［J］.Microbes Infect，2009;11(6-7):661-670.

7 Rogers N C，Slack E C，Edwards A D et al.Syk-dependent cytokine induction by Dectin-1 reveals a novel pattern recognition pathway for C type lectins［J］.Immunity，2005;22(4):507-517.

8 Gross O，Gewies A，F(xiàn)inger K et al.Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity［J］.Nature，2006;442(7103):651-656.

9 Gringhuis S I，den Dunnen J，Litjens M et al.Dectin-1 directs T helper cell differentiation by controlling noncanonical NF-kappaB activation through Raf-1 and Syk［J］.Nat Immunol，2009;10(2):203-213.

10 Zhu J，Paul W E.CD4 T cells:fates，functions，and faults［J］.Blood，2008;112(5):1557-1569.

11 Hernandez-Santos N，Gaffen S L.Th17 cells in immunity to Candida albicans［J］.Cell Host Microbe，2012;11(5):425-435.

12 林 莉(綜述)，曹雪濤(審閱).Th17細(xì)胞分化發(fā)育的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2009;16(2):191-194.

13 Kagami S，Rizzo H L，Kurtz S E et al.IL-23 and IL-17A，but not IL-12 and IL-22，are required for optimal skin host defense against Candida albicans［J］.J Immunol，2010;185(9):5453-5462.

14 Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method［J］.Methods，2001;25(4):402-408.

15 Taylor P R，Tsoni S V，Willment J A et al.Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection［J］.Nat Immunol，2007;8(1):31-38.

16 Ferwerda B，F(xiàn)erwerda G，Plantinga T S et al.Human dectin-1 deficiency and mucocutaneous fungal infections［J］.N Engl J Med，2009;361(18):1760-1767.

17 Netea M G，Brown G D，Kullberg B J et al.An integrated model of the recognition of Candida albicans by the innate immune system［J］.Nat Rev Microbiol，2008;6(1):67-78.

18 Zhu S，Qian Y.IL-17/IL-17 receptor system in autoimmune disease:mechanisms and therapeutic potential［J］.Clin Sci(Lond)，2012;122(11):487-511.

19 Ghoreschi K，Laurence A，Yang X P et al.T helper 17 cell heterogeneity and pathogenicity in autoimmune disease［J］.Trends Immunol，2011;32(9):395-401.