雞胚發育過程N-Cadherin和Neurofilament在視頂蓋中的表達模式研究①

楊慈清 李小英 付蘇雷 趙善廷 林俊堂

(新鄉醫學院生命科學技術學院，新鄉453003)

神經鈣黏蛋白(N-cadherin)是一種跨模型糖蛋白，在脊椎動物中樞神經系統的表達呈明顯的區域性［1］，其表達模式具有明顯的時空性特點，在胚胎發育早期主要表達在細胞增殖旺盛的區域，并且在白質區的表達明顯強于灰質區。N-Cadherin參與神經元遷移、神經突觸形成、突觸連接等功能［2，3］。神經絲蛋白(Neurofilament，NF)可以較靈敏地反映神經軸突的形態變化，是構成神經元胞體和神經軸突細胞骨架的主要成分，在維護神經元的功能和脊髓損傷修復相關的病理生理變化中發揮著重要作用，故NF作為神經骨架蛋白的指標可提示神經元生長的狀態［4］。在胚胎發育過程中，N-Cadherin和 NF在中樞神經系統中的表達具有明顯的相關性，前期研究結果表明在脊髓中N-Cadherin和NF表達呈時空性變化，最強表達出現在胚胎發育的E6-E8時。本研究對N-Cadherin和NF在雞胚發育過程視頂蓋中的表達模式進行研究，從而系統性的分析了NCadherin和NF在中樞神經系統中的表達模式，為進一步研究其功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 新鮮種雞蛋(當地種雞場);一抗Rabbit anti chicken N-Cadherin單克隆抗體(Redies實驗室饋贈)、Mouse anti Neurofilament(Redies實驗室饋贈);二抗Goat anti rabbit Cy3標記(Molecular Probes);二抗Goat anti mouse FITC標記(Jackson ImmunoResearch);Mounting Medium with DAPI(中杉金橋);Nikon ECLIPSE 80i熒光顯微鏡(日本 NI-KON);CM1850冰凍切片機(德國Leica)。

1.2 方法

1.2.1 雞胚培養 從種雞廠購買新鮮受精雞蛋，當天帶回實驗室，用溫水洗凈、擦干，水平放入孵化箱，溫度37.8℃，濕度60%，轉蛋間隔2小時，從孵育第6天(E6)開始收集胚胎，分別在E6-E20，每隔1天取材，各取3個胚胎。新鮮組織切下視頂蓋，置于4%PFA(多聚甲醛)中，在保溫盒冰內搖床搖晃過夜，取出組織，吸干液體，轉移到18%蔗糖溶液置冰中搖晃過夜，等沉淀到管底部時取出組織吸干液體，根據組織大小，用錫箔紙做好模型，用OCT包埋，注意方向，確定冠狀切面的位置，置于液氮中冷凍后放-80℃冰箱儲存備用。

1.2.2 切片 從-80℃冰箱取出已包埋的組織，在冰凍切片機上連續切片，冠狀切片，一次10張載玻片，每張片子根據組織大小循環貼2行，5～10列，切片后置烤片機37℃烤片30分鐘以上，置-80℃冰箱保存備用。

1.2.3 熒光免疫組織化學 從-80℃低溫冰箱中取出的冰凍切片40℃干燥20分鐘，4%PFA中4℃固定15分鐘，用1×TBS(Tris緩沖鹽水:10 mmol/L的 Tris含0.9%NaCl，用1 mol/L HCl調 pH 至7.4)清洗3次，每次5分鐘，在含0.1%Triton X-100的1×TBS中再孵育5分鐘。每張載玻片上加1 ml免疫組化封閉液，濕盒中孵育1小時。去除封閉液后每張載玻片加300 μl經用封閉液稀釋的合適濃度抗N-Cadherin(1∶500)一抗，4℃孵育過夜后，1×TBS清洗3次，每次5分鐘，然后每張片加300 μl封閉液稀釋的Cy3標記的針對一抗的二抗(1∶500稀釋)，室溫孵育1小時后，用1×TBS清洗3次，每次5分鐘。然后加抗 NF(1∶100)一抗，4℃孵育過夜后，1×TBS清洗3次，每次5分鐘，然后每張片加300 μl封閉液稀釋的用FITC標記的針對一抗的二抗(1∶500稀釋)，室溫孵育1小時后，用1×TBS清洗3次，每次5分鐘。最后滴加DAPI封片劑染色10分鐘，加蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察拍照，用Photoshop CS3軟件處理圖片，可將3種染色同位拼合在一起，從而分析不同蛋白質的表達定位。

2 結果

2.1 神經鈣黏蛋白的表達模式 雞胚發育到E6時，通過冰凍切片，可以看到(圖1C)視頂蓋已經形成明顯的3層結構，此時，檢測N-Cadherin的表達結果顯示，N-Cadherin主要在神經上皮(Neuroepithelium，NE)和新生區(Generative zone，GZ)兩層呈強陽性表達。而在E8時(圖1G)，視頂蓋明顯增厚，并且出現新的層，此時N-Cadherin除在NE層強表達外，在邊沿區(marginal zone，mZ)的表達也很強。在E10時(圖1K)，N-Cadherin主要分布在NE、視神經層(Presumptive stratum opticum，PSO)、前表面灰質纖維層(Presumptive stratum griseum and fibrosum superficiale，PSGFS)和亞室管膜層(Sub-ventricular zone，SVZ)。E12之后視頂蓋6層的結構基本形成，只是表面灰質纖維層(Stratum griseum fibrosum superficiale，SGFS)層各亞層到E18時才能夠全部形成，從圖(圖1N-F’)中可以看到，N-Cadherin在E12之后各層都有不同強度的表達，但相對而言，在中央灰質層(Stratum griseum central，SGC)的表達較弱，而在SGFS層的表達最強，但在SGFS層并不是均一表達，而呈現明顯的層的結構，因為在SGFS層進一步可以分a-j等10個亞層，每層的細胞類型和大小都是不同的，是結構最為復雜的一層，但是，無論是在胚胎發育的早期，還是后期，N-Cadherin主要表達在細胞核密度較小的區域，這也告訴我們N-Cadherin雖然是一種跨膜性糖蛋白，但是在神經纖維中的表達量明顯要高，由此，我們對神經絲蛋白的表達模式進行了同步分析。

2.2 神經絲蛋白的表達模式及其與N-Cadherin表達的異同 在E6時神經絲蛋白(Neurofilament，NF)明顯的可以看到表達在GZ層(圖1B)，而該層結構也是新生層，是纖維密集分布的區域;在E8時主要表達在IZ層(圖1F);在E10時(圖1J)，在前視神經層(Presumptive stratum opticum，PSO)的表達很強，除此，在SVZ區也有明顯的表達，此時NF的表達明顯的與N-Cadherin的部分表達恰好重疊(圖1L)。從E12之后，NF主要表達在SAC層和SO層，與N-Cadherin只在這兩層結構上重疊，在E14之后，表達強度減弱，在E20時仍然在SAC層和SO層上能夠檢測到其表達。為了更清楚地標記視頂蓋SGFS層，用Brn2單克隆抗體標記視頂蓋Ⅱ-Ⅲ層(圖1H’)，從結果可以看到，Brn2是一種細胞核抗原，抗體識別并標記出SGFS和SGC兩層的細胞核，但此時仍然很難清楚地分出SGFS層各亞層的結構。

圖1 N-Cadherin和NF表達模式Fig.1 The patterns of N-Cadherin and neurofilament expression

3 討論

胚胎發育早期在中樞神經系統有眾多的蛋白開始表達，N-Cadherin和NF是其中兩種，并且二者的表達存在相關性，N-Cadherin和NF主要分布在中樞神經系統的白質區和神經纖維密集分布的區域，并且NF的表達與神經功能的形成具有密切的關系［5］，雞胚視頂蓋是視神經密集分布的組織結構，是研究神經元遷移的理想部位，因此本研究對視頂蓋中N-Cadherin和NF的表達模式進行了系統性的研究。從N-Cadherin和NF的表達模式上可以看出，二者部分區域存在共表達的模式，NF表達的區域同樣有N-Cadherin的表達。如SO層，該層結構是視神經密集分布的一層，視頂蓋神經傳輸的最為重要的一層結構，在該層二者的表達都很強，并且從結果上可以看出，二者在胚胎發育前期的表達明顯高于后期，是由于在胚胎發育前期是神經元形成、成熟和遷移的重要階段，神經元的遷移需要神經纖維的幫助，也提示N-Cadherin和NF在細胞遷移方面具有重要功能。N-Cadherin主要的功能是起到細胞之間黏著作用，除此之外，也有報道N-Cadherin參與中樞神經系統的分區、形態發生和神經纖維的投射等眾多功能［6］。最新研究報道N-Cadherin是多級神經元遷移過程中的關鍵分子［7］，受神經元遷移關鍵分子的Reelin調控［8］。N-Cadherin主要影響非膠質細胞依賴性神經元的遷移，同時也對膠質細胞依賴性的神經元遷移具有調控功能［9］。為了更清楚研究N-Cadherin的功能，我們對N-Cadherin在雞胚中樞神經系統中的表達模式進行研究，在準確掌握其表達模式的基礎上研究N-Cadherin的功能。結果表明，N-Cadherin在胚胎發育早期的中樞神經系統中就有強的表達，而且具有明顯的時空性，在脊髓中從胚胎發育E4開始，到E6-E8時達到高峰，而在視頂蓋中的表達從能夠進行切片的E6開始，就可以檢測到強的表達，并且有明顯的層的分布，在不同層中的表達強度各不相同。因此，從表達模式上來看，要準確研究N-Cadherin在活體內的功能，必須從胚胎發育的早期進行N-Cadherin的超異常表達。Kadowaki等［10］通過條件型基因敲除方法對NCadherin在小鼠大腦皮層形成過程的功能進行了研究，結果表明，N-Cadherin沉默后，影響小鼠大腦皮層各層細胞的正確分布，并且改變海馬區的組織學結構，N-Cadherin是胚胎發育過程中非常重要的分子，實現完全敲除后會影響胚胎的發育，采用RNAi技術實現部分沉默是研究其功能的理想模式。NCadherin和NF是在胚胎發育早期開始強表達的兩種分子，對其功能的研究，在活體動物體內，可以采用基因沉默的模型，相對而言對于自身高表達的蛋白如果進行基因超表達模型效果將不是很理想;另外，N-Cadherin在信號轉導過程中發揮重要作用，因此，要研究N-Cadherin的功能，闡明N-Cadherin的相關調控分子及其調控機制至關重要。

致謝:感謝德國耶拿大學Redies教授在實驗過程中給予Ncdh和NF抗體的饋贈和實驗的指導!

1 W?hrn J C，Nakagawa S，Ast M et al.Combinatorial expression of cadherins in the tectum and the sorting of neurites in the tectofugal pathways of the chicken embryo［J］.Neuroscience，1999;90(3):985-1000.

2 Shih W，Yamada S.N-cadherin as a key regulator of collective cell migration in a 3D environment［J］.Cell Adh Migr，2012;6(6):1-5.

3 Kadowaki M，Nakamura S，Machon O et al.N-cadherin mediates cortical organization in the mouse brain［J］.Dev Biol，2007;304(1):22-33.

4 楊慈清，石曉衛，胡阿珍.應用雞胚活體電轉GFP示蹤技術觀察脊髓左右兩側神經元纖維投射［J］.中國免疫學雜志，2012;28(8):718-721.

5 Yabe J T，Wang F S，Chylinski T et al.Selective accumulation of the high molecular weight neurofilament subunit within the distal region of growing axonal neurites［J］.Cell Motil Cytoskeleton，2001;50(1):1-12.

6 Redies C.Cadherins in the central nervous system［J］.Prog Neurobiol，2000;61(6):611-648.

7 Jossin Y，Cooper J A.Reelin，Rap1 and N-cadherin orient the migration of multipolar neurons in the developing neocortex［J］.Nat Neurosci，2011;14(6):697-703.

8 J Franco S J，Martinez-Garay I，Gil-Sanz C et al.Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex［J］.Neuron，2011;69(3):482-497.

9 Shikanai M，Nakajima K，Kawauchi T.N-cadherin regulates radial glial fiber-dependent migration of cortical locomoting neurons［J］.Commun Integr Biol，2011;4(3):326-330.

10 Kadowaki M，Nakamura S，Machon O et al.N-cadherin mediates cortical organization in the mouse brain［J］.Dev Biol，2007;304(1):22-33.