Lactobacillus casei胞外多糖對體外培養的巨噬細胞分泌TNF-α、NO及IL-10的影響①

徐智敏 唐彥君 劉 寧

(東北農業大學食品學院乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030)

巨噬細胞在免疫系統中占據著獨一無二的位置，是機體發揮防御機制的基礎［1］。當病原微生物入侵機體時，能夠激活巨噬細胞分泌炎癥介質來殺滅病原微生物，發揮其防御機制。但是如果巨噬細胞一直處于激活狀態會釋放過量的炎癥因子，如NO、TNF-α等，從而造成瀑布式的炎癥失控性反應，使組織損傷并成為炎癥［2］。因此，尋找一種能夠調節巨噬細胞活性，改善炎癥反應的物質，將對維持免疫系統平衡具有重要的意義。Jie-Young Song等人研究發現人參能夠促進巨噬細胞分泌促炎癥因子IL-1β和IL-6，提高巨噬細胞的防御能力［3］。但從改善炎癥反應方面，抑制這些促炎癥因子的作用卻未見報道。本研究通過采用雙抗體夾心ELISA和Griess法，研究干酪乳桿菌EPS對體外培養的腹腔來源巨噬細胞分泌促炎癥因子TNF-α和NO及抗炎癥因子IL-10的影響。旨在探討干酪乳桿菌胞外多糖對體外培養的巨噬細胞的雙向調節機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 BALB/c雌性小鼠，體質量18～20 g，周齡6周，SPF級，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司(批號:2012-021316)，飼養于哈爾濱醫科大學公共衛生學院動物實驗中心無特定病原體動物室，環境溫度24℃，濕度40% ～60%，光照12小時，實驗前先將動物用標準飲食飼養7天以適應環境;J774A.1小鼠單核巨噬細胞(購于中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心);干酪乳桿菌(購自于美國ATCC，編號:ATCC393TM);干酪乳桿菌胞外多糖(由本實驗室經干酪乳桿菌ATCC393TM發酵自制，純度為97%);小鼠 TNF-α ELISA檢測試劑盒(Sigma公司);小鼠IL-10 ELISA檢測試劑盒(Sigma公司);LPS(Sigma公司);NO檢測試劑盒(南京建成);DMEM高糖培養液(Hylcone公司)。

1.2 主要儀器 VD-1320型無菌操作臺(北京東聯哈爾儀器制造廠);HF90型CO2培養箱(HealFroce公司);AE-31型倒置顯微鏡(MOTIC公司);酶聯免疫檢測儀(美國Bio-Rad公司);真空冷凍干燥機(上海醫用儀器廠);GL-21M超速冷凍離心機;ZFQ85B旋轉蒸發器(上海醫械專機廠);DHP-9082電熱恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 J774A.1 小鼠單核巨噬細胞的培養J774A.1細胞以1.0×105密度接種于50 ml塑料培養瓶中，用含10%胎牛血清與1%抗生素的DMED高糖培養液培養，置于37℃、5%CO2培養箱中，2～3天后待細胞匯合成單層細胞，用細胞刮將細胞輕刮下來，并轉移至新的塑料培養瓶中進行次代培養。

1.3.2 小鼠腹腔巨噬細胞的制備與培養 實驗前3天，向小鼠腹腔內注射2%淀粉肉湯2 ml，小鼠頸椎脫臼處死，置于75%酒精浸泡3分鐘后取出，腹面朝上，用鑷子提起小鼠下腹部皮膚，剪開一小口，撕開皮膚(小心勿將腹膜撕破)，完全暴露腹膜。用注射器向小鼠腹腔注射6 ml Hanks液，避開腸和脂肪，輕輕地回抽腹腔液，不同方向回抽沖洗數次(需要5分鐘左右的時間)，吸出腹腔液于離心管中，以1 000 r/min離心5分鐘，棄上清后，用DMEM高糖培養液重新懸浮細胞，置CO2培養箱，37℃培養2小時使巨噬細胞貼壁，然后用PBS洗去懸浮細胞。更換新鮮的DMEM高糖培養液，繼續培養12小時后用于實驗［4］。

1.3.3 設計及分組 在96孔板中每孔加入細胞懸液100 μl(1.0×105)，進行分組處理，分為空白對照組;胞外多糖處理組;脂多糖處理組;胞外多糖和脂多糖共處理組。

1.3.4 細胞因子的檢測 收集細胞培養上清液，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測細胞培養上清液中 TNF-α、IL-10的濃度，實驗按照ELISA試劑盒操作步驟來進行。采用Griess法測定細胞培養上清液中NO2－間接反映生成NO的量，按照NO檢測試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 EPS對腹腔巨噬細胞形態學影響 如圖1和2所示，在倒置顯微鏡下觀察J774A.1巨噬細胞和原代腹腔巨噬細胞的細胞形態。空白對照組，沒有外來物質刺激腹腔來源的巨噬細胞時，細胞的形態是圓形的;當用炎癥刺激物LPS作用細胞后，腹腔來源的巨噬細胞形態發生較大的變化，由原來的圓形變成梭形，細胞邊緣有樹突狀突起;用200 μg/ml的EPS處理細胞后，部分細胞形態由梭形、樹突狀恢復到橢圓形;當用400 μg/ml的EPS處理細胞后大部分細胞形態都由梭形、樹突狀恢復到原來的圓形。說明EPS能夠恢復由脂多糖導致的巨噬細胞形態的變化。

2.2 EPS對腹腔來源巨噬細胞分泌促炎癥因子TNF-α的影響 如圖3所示，與空白對照組相比，不同濃度的EPS均能顯著地促進腹腔巨噬細胞分泌TNF-α(P ＜0.01);EPS在350 ～ 450 μg/ml濃度范圍內，腹腔巨噬細胞分泌TNF-α的量是先增多后減少，EPS濃度為 400 μg/ml時，J774A.1 和原代腹腔巨噬細胞分泌 TNF-α的量分別達到最大值(458.18 ±8.679)pg/ml 和(387.28 ± 8.354)pg/ml。LPS能夠促進腹腔巨噬細胞產生大量的TNF-α，與單獨脂多糖組相比，不同濃度的EPS均能抑制由10 μg/ml LPS誘導的TNF-α的分泌;450 μg/ml濃度的EPS對J774A.1和原代腹腔巨噬細胞產生TNF-α的抑制率最大。

2.3 EPS對腹腔來源巨噬細胞分泌抗炎癥因子IL-10的影響 如圖4所示，與空白對照組相比，不同濃度的EPS均能顯著地促進腹腔巨噬細胞分泌IL-10(P ＜0.01);EPS在 350～ 450 μg/ml濃度范圍內，腹腔巨噬細胞分泌IL-10的量是先增多后減少，EPS濃度為400 μg/ml時J774A.1和原代腹腔巨噬細胞分泌IL-10的量分別達到最大值(74.18±3.924)pg/ml和(59.761 ±3.46)pg/ml。單獨脂多糖處理組，抑制腹腔巨噬細胞分泌IL-10，不同濃度的EPS均能顯著影響由10 μg/ml脂多糖導致的IL-10分泌的抑制(P ＜0.01)。

圖1 倒置顯微鏡觀察LPS和EPS對J774A.1細胞形態的影響(×400)Fig.1 Morphologic feature of J774A.1 cells treated with EPS and LPS was photographed using an inverted phase microscop(×400)

圖2 倒置顯微鏡觀察LPS和EPS對原代腹腔巨噬細胞形態的影響(×200)Fig.2 Morphologic feature of macrophages treated with EPS and LPS was photographed using an inverted phase microscop(×200)

2.4 EPS對腹腔來源巨噬細胞生成NO的影響如圖5所示，與空白對照組相比，不同濃度的EPS均能顯著地促進腹腔巨噬細胞分泌NO(P＜0.05);EPS在350～450 μg/ml濃度范圍內，腹腔巨噬細胞分泌NO的量是先增多后減少，EPS濃度為400 μg/ml時J774A.1和原代腹腔巨噬細胞分泌NO量分別達到最大值(28.191 ±0.697)μmol/L 和(25.969 ±0.587)μmol/L。脂多糖能夠促進腹腔巨噬細胞產生大量的NO;與單獨脂多糖組相比，不同濃度的EPS均能抑制由10 μg/ml脂多糖誘導的NO的分泌，450 μg/ml濃度的 EPS對 J774A.1和原代腹腔巨噬細胞產生NO的抑制率最高或抑制作用最強。

圖3 EPS對腹腔來源巨噬細胞分泌促炎癥因子TNF-α的影響Fig.3 Production of the proinflammatory factor TNF-α in culture supernatants of macrophages treated with EPS

圖4 EPS對腹腔來源巨噬細胞分泌抗炎癥因子IL-10的影響Fig.4 Production of the anti-inflammatory factor IL-10 in culture supernatants of macrophages treated with EPS

圖5 EPS對腹腔來源巨噬細胞生成NO的影響Fig.5 Production of nitric oxide in culture supernatants of macrophages treated with EPS

3 討論

巨噬細胞在炎癥反應中發揮重要作用，其產生的多種細胞因子和炎癥介質是炎癥反應發生、發展、協調和消散的內在機制［5］。TNF-α是細胞因子網絡的啟動因子，在炎癥反應中TNF-α不僅能直接參與炎癥反應，還能誘導其他細胞因子釋放，共同對組織造成損傷［6］。它與其他細胞因子形成相互作用的信號網絡，刺激細胞合成，表達IL-1β。IL-1β和TNF-α通過協調作用誘發炎癥反應［7］。IL-10能夠抑制單核巨噬細胞釋放炎癥介質，抑制LPS所致的TNF-α、IL-1β、IL-6和 NO 的分泌。此外，它能增強抗炎癥因子的釋放，如IL-1受體拮抗劑和溶解性TNF-α受體［8］。因此IL-10對機體維持穩態平衡發揮重要的作用。NO是激活的巨噬細胞殺滅病原微生物及腫瘤細胞的主要效應分子，能提高機體免疫，但過量的NO也會促進炎癥發生，誘導炎癥細胞因子如 TNF-α、IL-1β等。在炎癥反應初期，適量的TNF-α、NO是機體對抗炎癥的積極反應，但是如果它們持續不斷地釋放則會導致炎癥的不斷擴大、加重。所以，保持適量的 TNF-α、NO和IL-10等細胞因子對機體穩態平衡具有重要作用。

近年來大量的研究都集中在真菌多糖、植物多糖對巨噬細胞的單方向調節作用，而食品級乳酸菌胞外多糖對巨噬細胞的雙向調節機制未見報道。Anwei Cheng［1，9］等研究發現烏拉爾甘草多糖能夠促進巨噬細胞分泌炎癥因子IL-6、IL-12和NO，而LPS能夠促使巨噬細胞分泌過量的炎癥因子IL-6、IL-12和NO而引發炎癥反應。尋找一種能夠雙向調節巨噬細胞活性，改善炎癥反應，維持免疫系統平衡的物質將是現在以及未來的研究熱點。

李敏等［10］研究發現，巨噬細胞受IFN-γ等細胞因子和LPS誘導活化后，會合成并釋放大量TNF-α、IL-1β、IL-6和NO等炎癥介質，加重機體的炎癥反應，對組織器官造成損傷。此時就需要抑制促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和 NO 等的過度釋放，并且要促進抑炎癥因子如IL-10等的釋放，調節并維持機體的穩態平衡。本研究中，EPS激活正常的腹腔巨噬細胞，促進TNF-α、NO及少量的IL-10產生，活化細胞殺滅病原微生物，發揮積極作用。LPS誘導巨噬細胞后，TNF-α和NO的分泌增加，IL-10分泌急劇減少，加重機體的炎癥反應。EPS能抑制經LPS處理后巨噬細胞的活化，維持免疫系統的平衡，因此EPS可能是LPS的抑制劑，EPS可能影響LPS的結構，也有可能EPS和LPS相互作用，發生了化學反應形成了一種新的物質，LPS和EPS之間的相互作用還有待于進一步深入研究。

本研究發現EPS能夠促進正常巨噬細胞增殖活化并釋放TNF-α、NO和IL-10，增強機體免疫力。當巨噬細胞受LPS誘導活化后，EPS會使TNF-α、NO分泌減少，促進IL-10的產生，表明EPS可以通過抑制TNF-α和NO的產生，促進IL-10的產生發揮抗炎作用，進一步揭示了干酪乳桿菌胞外多糖通過體外影響腹腔巨噬細胞的作用發揮其調節免疫的機制。

1 Igor A Schepetkin，Gang Xie，Liliya N Kirpotina.Macrophage immunmodulatory activity of polysaccharides isolated from Opuntia polyacantha［J］.Int Immunopharmacol，2008;8(10):1455-1466.

2 Libby P，Ridker P M，Maseri A.Inflammation and atherosclerosis［J］.Circulation，2002;105(9):1135-1143.

3 Song J Y，Han S K，Son E H et al.Induction of secretory and tumoricidal activities in peritoneal macrophages by ginsan［J］.Int Immunopharmacol，2002;2(7):857-865.

4 Jung A Byun，Mi Hyun Ryu，Jong Kwon Lee.The immunomodulatory effects of 3-monochloro-1，2-propanediol on murine splenocyte and peritoneal macrophage function in vitro［J］.Toxicol In Vitro，2006;20(3):272-278.

5 Jin-Yuarn Lin，Ching-Yin Tang.Strawberry，loquat，mulberry，and bitter melon juices exhibit prophylactic effects on LPS-induced inflammation using murine peritoneal macrophages［J］.Food Chem，2008;107(4):1587-1596.

6 Hasleton P S，Roberts T E.Adult respiralory distress syndrome-an update［J］.Histopathology，1999;34(3):285-294.

7 龐廣昌.食品免疫論-關于胃腸黏膜免疫和細胞因子網絡的科學［M］.北京:科學出版社，2008:479-487.

8 張學軍，崔雪玲，勞風學 et al.激活素A對小鼠巨噬細胞分泌IL-1β的影響［J］.中國免疫學雜志，2005;21(8):575-578.

9 Anwei Cheng，Fachun Wan，Jiaqi Wang et al.Macrophage immunomodulatory activity of polysaccharides isolated from Glycyrrhiza uralensis fish ［J］.Int Immunopharmacol，2008;8(1):43-50.

10 李 敏，劉耕陶.雙環醇對脂多糖誘導巨噬細胞iNOS蛋白的表達和NF-κB活化的抑制作用［J］.中國藥理學通報，2006;22(12):1438-1443.