漿細(xì)胞性乳腺炎患者外周血CD4+CD25+CD127－調(diào)節(jié)性T細(xì)胞變化①

付 嘉 熊 斌 司傳平 方艷秋 譚 巖 李繼斌

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院免疫教研室，濟(jì)寧272067)

漿細(xì)胞性乳腺炎(Plasma cell mastitis，PCM)是一種非感染性良性乳腺炎癥［1］。PCM的病因至今不完全明了，更多的病理學(xué)的證據(jù)表明在PCM病灶局部浸潤(rùn)大量漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、吞噬脂肪的泡沫細(xì)胞等［1，2］，提示機(jī)體自身免疫應(yīng)答在該病的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。資料顯示CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞 (CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cell，Treg)數(shù)量減少或功能異常與多種自身免疫病相關(guān)［3-5］，但對(duì)于 PCM 患者 CD4+CD25+Foxp3+Treg是否有變化國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究PCM患者共58例，年齡25～59歲，平均為(38.6±6.2)歲，均為經(jīng)產(chǎn)婦、非哺乳期婦女。術(shù)前細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查及術(shù)后冰凍切片檢查確認(rèn)為PCM。按照Hartley的方法根據(jù)臨床表現(xiàn)將 PCM 分為三期［8］:① 急性組 13例(22%):伴有乳房腫塊12例，乳頭溢液5例，乳腺疼痛10例，乳頭內(nèi)陷 6例;②亞急性組 25例(43%):伴有乳房腫塊23例，乳腺疼痛15例，乳頭溢液13例，乳頭內(nèi)陷9例，乳腺瘺形成4例;③慢性組20例(34%):伴有乳房腫塊15例，乳頭溢液12例，乳腺疼痛8例，乳頭內(nèi)陷15例，乳腺瘺形成9例，橘皮樣外觀10例，淋巴結(jié)腫大9例，見(jiàn)表1。

1.2 主要儀器與試劑 流式細(xì)胞儀FACSCalibur(BD公司);抗人 PE-Cy5-anti-CD4、Alexa Fluor488-anti-CD25、PE-anti-CD127及同型對(duì)照(均為 eBioscience)、TRIZOL(Invitrogen)，第一鏈cDNA合成試劑盒和 Oligo(dT)引物(均為 Fermentas);SYBR Green PCR Master Mix(Toyobo);實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀 ABI Prism 7900(Applied Biosystems);人TGF-β檢測(cè)試劑盒(eBioscience)。

1.3 方法

1.3.1 人CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞的檢測(cè)無(wú)菌取人抗凝靜脈血，肝素抗凝。取100 μl全血，分別加入抗人PE-Cy5-anti-CD4、Alexa Fluor488-anti-CD25、PE-anti-CD127 各5 μl，另設(shè)同型對(duì)照管，補(bǔ)償管，短時(shí)渦旋后4℃避光孵育20～30分鐘，加入紅細(xì)胞裂解液2 ml，短時(shí)渦旋后室溫孵育15分鐘。以2 ml PBS 1 000 r/min離心洗滌5分鐘，棄上清，將細(xì)胞懸浮于0.5 ml PBS洗滌液中，振蕩混勻后上機(jī)檢測(cè)，圈定淋巴細(xì)胞為R1門(mén)內(nèi)細(xì)胞，CD4+細(xì)胞為R2門(mén)內(nèi)細(xì)胞，測(cè)定CD25+CD127-細(xì)胞占 CD4+細(xì)胞的百分率。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)人PBMC中Foxp3表達(dá) 引物設(shè)計(jì):Foxp3引物P1:5'-GTGGCATCATCCGACAAGG-3'和 P2:5'-TGTGGAGGAACTCTGGGAAT-3'，GAPDH 引物 P3:5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'和 P4:5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。用Trizol試劑提取人PBMC總mRNA，用DNaseⅠ去除痕量DNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。用第一鏈cDNA合成試劑盒和Oligo(dT)引物合成Foxp3 cDNA，用SYBR Green PCR Master Mix試劑及ABI Prism 7900熒光定量PCR儀定量檢測(cè)cDNA。基因的相對(duì)表達(dá)量用△△CT法。GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參照，無(wú)模板樣本作為陰性對(duì)照。

1.3.3 ELISA法檢測(cè)人血漿TGF-β含量 無(wú)菌取人抗凝靜脈血，肝素抗凝。吸取血漿層凍于-80℃?zhèn)溆谩Ｊ褂萌薚GF-β檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血漿TGF-β含量，按照說(shuō)明書(shū)操作。

2 結(jié)果

2.1 各進(jìn)展期PCM患者的臨床表現(xiàn) 統(tǒng)計(jì)各進(jìn)展期PCM患者臨床表現(xiàn)，其中急性期13例(22%)，亞急性期25例(43%)，慢性期20例(34%)。各期PCM患者都出現(xiàn)乳房腫塊、乳房溢液、乳腺疼痛和乳頭內(nèi)陷等癥狀，亞急性期PCM患者還形成乳腺瘺(4/25)，慢性期患者還出現(xiàn)橘皮樣外觀和淋巴結(jié)腫大等癥狀(見(jiàn)表1)。

表1 PCM患者在各期的臨床表現(xiàn)Tab.1 Clinical manifestation of patients with plasma cell mastitis during three stages

2.2 PCM患者外周血中CD4+CD25+CD127-T細(xì)胞百分率變化 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，三組PCM患者外周血CD4+CD25+CD127-T細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的百分率均較正常組降低(P＜0.05)，其中急性期PCM組下降明顯(P＜0.01)。乳腺癌組CD4+CD25+CD127-T細(xì)胞百分率與對(duì)照組相比，明顯升高(P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

2.3 PCM患者外周血PBMC中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)變化 亞急性組PCM患者外周血PBMC中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)與正常組相比降低(P＜0.05)，急性期PCM組Foxp3表達(dá)下降明顯(P＜0.01)。乳腺癌組外周血PBMC中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)與對(duì)照組相比，明顯升高(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

2.4 PCM患者血漿TGF-β水平變化 三組PCM患者血漿TGF-β水平與正常組相比均降低(P＜0.05)，其中急性期PCM組血漿TGF-β水平下降明顯(P＜0.01)。乳腺癌組血漿TGF-β水平與對(duì)照組相比，明顯升高(P＜0.05)。見(jiàn)圖3。

圖1 PCM患者外周血中CD4+CD25+CD127－T細(xì)胞百分率變化Fig.1 Detection of CD4+CD25+CD127－cells in acute PCM，subacute PCM and chronic PCM

圖2 PCM患者外周血Foxp3 mRNA的表達(dá)Fig.2 Foxp3 mRNA expression in patients with PCM

圖3 PCM患者血漿TGF-β水平Fig.3 TGF-β concentration in plasma from patients with PCM

3 討論

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)可根據(jù)來(lái)源不同分為自然 Treg(nTreg)和適應(yīng)性 Treg(iTreg)。nTreg在胸腺中分化、成熟，主要來(lái)源于CD4+CD25-胸腺細(xì)胞，在CD4+T細(xì)胞的自然選擇過(guò)程中生成并獲得CD4+CD25+Foxp3+表型。iTreg來(lái)自于外周的CD4+T細(xì)胞，包括三個(gè)亞群:Tr1、Th3和 Foxp3+表型 iTreg［7］。CD4+CD25+Treg 是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中最受關(guān)注的一群，其職能是維持機(jī)體自身耐受、控制移植排斥和超敏反應(yīng)，在感染和腫瘤時(shí)抑制效應(yīng)細(xì)胞功能，并防止自身免疫病的發(fā)生［9-12］。CD4+CD25+Treg占人和小鼠外周血CD4+T細(xì)胞的5% ～10%，除高表達(dá)CD25(IL-2受體α鏈)外，還表達(dá) CD127-、CD45RBlow、GITR、CTLA-4、LAG-3、CCR4、CCR7、CD62Lhigh及 neuropilin-1 等表面分子［7］。叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子 Foxp3(Forkhead/winged helix transcription factor)對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞在胸腺內(nèi)發(fā)育和功能維持是必需的［13］。而Treg的另一個(gè)重要標(biāo)志CD127-(IL-7Ra-)常被用于區(qū)別于效應(yīng)性 CD4+T 細(xì)胞及其分離［6，7］。CD4+CD25+Treg的靶細(xì)胞涉及 CD4+CD25-T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和DC，其作用于靶細(xì)胞的方式有:分泌抑制性細(xì)胞因子TGF-β1、IL-35和IL-10;細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸的溶細(xì)胞作用;干擾靶細(xì)胞代謝;調(diào)節(jié)DC的成熟及功能［7］。

漿細(xì)胞性乳腺炎(PCM)是一種以非周期性乳房疼痛、乳頭溢液、乳頭凹陷、乳暈區(qū)腫塊、非哺乳期乳房膿腫、乳頭部瘺管為主要臨床表現(xiàn)的炎癥樣特殊類(lèi)型乳腺良性疾患，占乳房良性病變的4% ～5%。近年來(lái)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)［2］。PCM臨床表現(xiàn)復(fù)雜，故而命名也不盡相同，如乳管周?chē)腿橄傺住⑷楣軐?dǎo)管擴(kuò)張癥等，有學(xué)者認(rèn)為每種病名僅反映其疾病過(guò)程的某一病理階段。根據(jù)Hartley的方法可將PCM分為三期［8］:急性期:具有乳腺急性炎癥的表現(xiàn)，可在乳暈周?chē)霈F(xiàn)紅腫、疼痛，伴輕度發(fā)熱，全身中毒癥狀不明顯;亞急性期:急性炎癥已消退，遺留下硬結(jié)或腫塊，也可繼發(fā)感染形成乳腺瘺;慢性期:乳房腫塊縮小，可出現(xiàn)乳頭內(nèi)陷，甚至橘皮樣改變或淋巴結(jié)腫大，膿腫反復(fù)發(fā)作、破潰或形成竇道，腫塊可持續(xù)數(shù)年不等。PCM病理學(xué)證據(jù)表明乳腺導(dǎo)管周?chē)霈F(xiàn)脂肪壞死及大量漿細(xì)胞浸潤(rùn)，淋巴細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)，其中以漿細(xì)胞浸潤(rùn)更為明顯，另有數(shù)量不等的泡沫狀組織細(xì)胞、多核巨細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞形成肉芽腫［14］。將PCM患者手術(shù)切除的乳腺病灶區(qū)組織勻漿接種于BALB/c小鼠，可建立PCM的動(dòng)物模型［15］。提示PCM是一種自身免疫反應(yīng)參與的疾病。

由于PCM的臨床表現(xiàn)及輔助檢查無(wú)特異性，故極易誤診，其中1/3病例被誤診為乳腺癌。故而，在對(duì)PCM進(jìn)行鑒別診斷時(shí)，排除乳腺癌是很重要的一個(gè)方面。研究顯示乳腺癌患者CD4+CD25+Treg數(shù)量明顯升高，參與癌癥的進(jìn)展［16］。為研究在自身免疫病中發(fā)揮重要作用的CD4+CD25+Treg是否參與PCM的疾病發(fā)生與進(jìn)展，我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組不同進(jìn)展期PCM患者及乳腺癌對(duì)照組患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞百分率;并以熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)，ELISA檢測(cè)血漿TGF-β含量。結(jié)果顯示，三組PCM患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg數(shù)量、外周血PBMC中Foxp3表達(dá)及血漿TGF-β水平均下降(P＜0.05)，其中急性PCM組下降最為明顯(P＜0.01)，提示PCM的疾病發(fā)生及進(jìn)展可能涉及Treg功能紊亂及重新分布。結(jié)果同時(shí)顯示與PCM臨床癥狀易發(fā)生混淆的乳腺癌患者外周血中CD4+CD25+CD127-Treg數(shù)量、外周血PBMC中Foxp3表達(dá)及血漿TGF-β水平均升高(P＜0.05)，與報(bào)道一致［16］。本研究顯示CD4+CD25+Treg在漿細(xì)胞乳腺炎疾病進(jìn)展中發(fā)揮作用，并且對(duì)PCM患者CD4+CD25+Treg數(shù)量的檢測(cè)也可為乳腺癌的鑒別診斷提供線索。

1 Ming J，Meng G，Yuan Q et al.Clinical characteristics and surgical modality of plasma cell mastitis:analysis of 91 cases［J］.Am Surg，2013;79(1):54-60.

2 高雅軍，馬祥君，汪 潔 et al.漿細(xì)胞性乳腺炎的研究進(jìn)展［J］.中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志，2012;8(6):792-795.

3 Thiruppathi M，Rowin J，Li Jiang Q et al.Functional defect in regulatory T cells in myasthenia gravis［J］.Ann N Y Acad Sci，2012;12(74):68-76.

4 Fujio K，Okamura T，Sumitomo S et al.Regulatory cell subsets in the control of autoantibody production related to systemic autoimmunity［J］.Ann Rheum Dis，2013;72(2)85-89.

5 Nishimoto T，Kuwana M.CD4(+)CD25(+)Foxp3(+)regulatory T cells in the pathophysiology of immune thrombocytopenia［J］.Semin Hematol，2013;50(1):43-49.

6 Liu W，Putnam A L，Yu Z X et al.CD127 expression inversely correlates with Foxp3 and suppressive function of human CD4+Treg cells［J］.J Exp Med，2006;203(12):1701-1711.

7 Elaine V Louren?o，AntonioLa Cava.Natural regulatory T cells in autoimmunity［J］.Autoimmunity，2011;44(1):33-42.

8 Hartley M N，Stewart J，Benson E A et al.Subareolar dissection for duct ectasia and periareolar sepsis［J］.Br J Surg，1991;78(10):1187-1188.

9 Wing K，Sakaguchi S.Regulatory T cells exert checks and balances on self tolerance and autoimmunity ［J］.Nat Immunol，2010;11(1):7-13.

10 Burrell B E，Nakayama Y，Xu J et al.Regulatory T cell induction，migration，and function in transplantation ［J］.J Immunol，2012;189(10):4705-4711.

11 Maazi H，Lam J，Lombardi V et al.Role of plasmacytoid dendritic cell subsets in allergic asthma ［J］.Allergy，2013;68(6):695-701.

12 Lal A，Chan L，Devries S et al.FOXP3-positive regulatory T lymphocytes and epithelial FOXP3 expression in synchronous normal，ductal carcinoma in situ，and invasive cancer of the breast［J］.Breast Cancer Res Treat，2013;139(2):381-390.

13 Ohkura N，Kitagawa Y，Sakaguchi S.Development and maintenance of regulatory T cells［J］.Immunity，2013;38(3):414-423.

14 左文述.現(xiàn)代乳腺腫瘤學(xué)［M］.第2版.濟(jì)南:山東科技出版社，2006:1395-1397.

15 Yu J J，Bao S L，Yu S L et al.Mouse model of plasma cell mastitis［J］.J Transl Med，2012;10(1):11.

16 Sisirak V，F(xiàn)aget J，Gobert M et al.Impaired IFN-α production by plasmacytoid dendritic cells favors regulatory T-cell expansion that may contribute to breast cancer progression ［J］.Cancer Res，2012;72(20):5188-5197.