類風濕關節炎滑膜組織及關節液中DcR3表達的研究①

陳安平 袁國華 羅雄燕 楊明輝 劉素蘭

(湖北民族學院風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室，恩施445000)

類風濕關節炎是一種主要累及關節滑膜，以滑膜炎癥反應、血管翳形成、軟骨及骨破壞為特征的一種常見的關節炎性疾病。DcR3是新近發現的一種腫瘤壞死因子誘騙受體，能與多種TNF家族成員如FasL、LIGHT、TL1A等結合，從而有效地抑制了相關腫瘤壞死因子所誘導的凋亡。近年來研究發現在許多自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡、矽肺、系統性硬化癥等患者的外周血單核細胞及血清中也存在DcR3的高表達。RA是一種發病率和致殘率均較高的一種風濕免疫性疾病，凋亡機制在RA的發病機制中占有重要地位。我們既往的研究發現DcR3在類風濕關節炎患者血清及外周血單核細胞中的表達明顯增高，而其血清表達水平在風濕活動較高的患者則更加明顯［1］。為了進一步探討DcR3在RA患者滑膜組織中的表達情況，本文通過對RA患者滑膜組織用免疫組織化學方法行DcR3表達的研究，并同時用ELISA的方法研究了RA患者關節液中DcR3的表達情況，報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 滑膜組織標本來自川北醫學院附屬醫院風濕科2009年9月至2010年5月手術患者的切除標本，其中RA患者12例，均符合1987年美國風濕病學會(ACR)分類標準，男性2例，女性10例，年齡26～69歲，平均(45±14)歲，病程2～12年。另有OA患者6例和無關節疾病的骨折患者4例作為對照。6例OA患者中男性2例，女性4例，年齡48～73歲，平均(60±11)歲，4例正常滑膜和軟骨組織來自男性3名，女性1名。年齡24～52歲。所有滑膜組織切片均用蘇木素—伊紅(HE)染色。根據滑膜炎性細胞浸潤程度，將滑膜炎記為l～3分:炎性浸潤細胞＜25個/視野為1分;炎性浸潤細胞25～100個/視野為2分;炎性浸潤細胞＞100個/視野為3分［2］。RA及OA患者關節液均取自膝關節，為2009年9月直2010年5月川北醫學院附屬醫院風濕科的住院病人，其中 RA患者26例，均符合1987年美國風濕病學會(ACR)分類標準，男性6例，女性20例，年齡45～72歲，平均(51±11)歲。另有OA患者19例，男性5例，女性14例，年齡55～76歲，平均(66±7)歲。采用無菌膝關節腔穿刺術，抽取關節液。1 500 r/min離心10分鐘，－80℃保存備用。

1.2 主要試劑 DAB顯色試劑盒購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司。皂素由BIO BASIC INC提供。鼠抗人DcR3 IgG單克隆抗體購自Santa Crutz公司。兔抗鼠二抗購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司。DcR3 ELISA試劑盒購自博士德生物工程有限公司。

1.3 DcR3的檢測 采用一步法免疫組織化學法檢測滑膜組織中DcR3的表達。簡要檢測步驟為:①滑膜標本行冰凍切片，厚為5 μm，經丙酮(50%)+異丙醇(50%)(4℃預冷)固定15～30分鐘;②加人0.2%皂素室溫放置30～45分鐘;③2%H2O2室溫作用15分鐘去除內源性過氧化物酶;④加入試劑盒中特異性多聚酶標記的鼠抗人單克隆一抗4℃過夜。以上各步驟之間均使用含0.02%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌至少3次，每次5分鐘;⑤加入二氨基聯苯胺(DAB)應用液作用5～20分鐘，顯微鏡下終止顯色，蘇木素復染。封片，顯微鏡下觀察結果。同時設立陰性對照:分別PBS代替一抗，其余步驟不變。

1.4 染色結果判定標準 在免疫組織化學染色的滑膜和軟骨組織，凡胞質中出現明顯的棕黃色至黃粉色顆粒者為DcR3陽性細胞。并根據細胞形態，鑒別滑膜組織中的細胞類型，包括滑膜襯里層細胞(SLC)、滑膜下層巨噬細胞樣細胞(MC)、成纖維樣細胞(FB)、血管內皮細胞(VE)和單個核白細胞(MNC)。每張組織切片在400倍視野下根據隨機計數原則確定顯微鏡的X軸和Y軸，隨機采集5個視野圖像，計算平均陽性細胞數分為5類:0:陽性細胞＜1%;1:陽性細胞占1% ～20%;2:陽性細胞占21% ～40%;3:陽性細胞占41% ～60%;4:陽性細胞＞60%。根據染色程度，將陽性信號分為4類:0分:沒有著色;1分:染色強度弱;3分:黃至棕黃色染色;2分:染色強度介于弱陽性與強陽性之間。將染色強度記分×陽性細胞百分數記分，為每例組織染色的最后綜合記分。綜合記分≥1為表達陽性，＜1則為陰性。記錄每個圖像所有類型細胞的總數、陽性細胞數和陽性細胞類型，計算平均值。

1.5 ELISA檢測關節液中DcR3的表達 按照試劑盒說明書進行配液，將標準蛋白及10倍稀釋的關節液樣本加入微孔板，加生物素-結合物(Biotinconjugate)孵育，洗板，加抗生物素蛋白鏈菌素-辣根過氧化物(streptavidin-HRP)孵育，再洗板，加四甲基聯苯胺(TMB)避光反應，加終止液終止反應，酶標儀450 nm處測量吸光值，由標準曲線求出各關節液樣本中DcR3的濃度。

1.6 統計學處理 免疫組化結果采用兩樣本構成比(率)比較的χ2檢驗。ELISA結果采用t檢驗。應用SPSS10.0軟件進行數據處理。

2 結果

2.1 DcR3在滑膜組織免疫組織化學染色結果RA、OA和正常滑膜組織DcR3的檢測結果見表1和圖1。圖1為RA組、OA組及正常對照組滑膜組織DcR3表達的免疫組化圖片。由表1可見，RA滑膜組織細胞中DcR3陽性細胞約為72%，主要分布于滑膜組織中滑膜襯里層細胞(SLC)、血管翳周圍的血管內皮細胞(VE)和單個核白細胞(MNC)等;而OA組織中DcR3陽性細胞數量較RA明顯減少。主要表達于滑膜襯里層細胞(SLC)和單個核白細胞(MNC)等，且陽性強度也較RA明顯減弱;而正常滑膜組織中少見DcR3陽性表達的細胞。

2.2 滑膜組織中DcR3的表達與滑膜組織炎性病變程度的相關性研究 由圖2可見DcR3的表達與滑膜組織的炎性程度成正相關關系(r=0.803，P＜0.01)。

2.3 RA與OA患者關節液中DcR3的表達量比較結果 由表2可見，RA及OA患者關節液中均可檢測到DcR3的表達，但RA組表達量明顯較高，與OA組比較差異具有統計學意義。

圖1 滑膜組織免疫組化圖片Fig.1 Immunohis tochemistry picture

表1 RA，OA和正常滑膜組織DcR3表達量比較Tab.1 The expression of DcR3 in synovial tissue of RA，OA and control groups

表2 RA與OA患者關節液中DcR3的表達量比較Tab.2 The expression of DcR3 in the synovia of RA and OA patients

3 討論

誘騙受體3(DcR3，又稱TR6)是1998年由Pitti等［2］發現的一種可溶性腫瘤壞死因子受體超家族成員，屬于分泌性蛋白。其特點在于DcR3雖然可與腫瘤壞死因子Fas、HVEM、DR3競爭結合其相應配體FasL、LIGHT及TLIA，但由于缺乏胞內區或者由于胞內死亡區不完整，而不能傳導凋亡信號，具有抑制細胞凋亡的作用，在細胞的生長、分化、死亡以及免疫調節等方面發揮重要作用，與多種疾病等密切相關。DcR3基因在人胚胎肺、腦、肝和成人脾、胃、結腸、肺、淋巴結、脊髓中存在低表達，但在人結腸癌細胞株SW480和SW1116中高表達。在人類惡性腫瘤如胃腸道腫瘤、肺癌、病毒相關淋巴瘤、原發性肝癌、胰腺癌、神經膠質瘤等及某些自身免疫疾病如進行性系統性硬化病、系統性紅斑狼瘡和矽肺患者的外周血單核細胞也能檢測到DcR3的高表達［4-11］。

圖2 DcR3與滑膜組織炎癥程度的相關性Fig.2 The correlation of the DcR3 expression and inflammatory lesion in the synovium

類風濕關節炎是一種常見的炎性關節病，雖然其主要靶器官是滑膜組織。大量研究顯示在RA的發病過程中關節局部的小分子炎癥介質、細胞因子、生長因子、趨化因子、粘附分子、基質金屬蛋白酶等吸引并活化來自外周血的炎癥細胞，觸發滑膜細胞的增殖和活化。病變隨后表現出局部腫瘤的生物學行為，侵襲并損壞關節軟骨、軟骨下骨、肌腱和韌帶。滑膜細胞周期失調及凋亡異常可導致關節滑膜組織過度增生、肥厚從而促進RA的發生［12］。DcR3可以在腫瘤細胞和惡性腫瘤組織中高表達，通過其抑制凋亡的作用參與腫瘤細胞的免疫逃逸。而病變的類風濕關節炎滑膜細胞在局部也表現了腫瘤的生物學行為，研究發現類風濕關節炎滑膜細胞同樣存在凋亡不足的現象。Hayashi等［13］用ELISA的方法研究了OA和RA患者血清及關節液中DcR3的表達情況，結果發現RA患者血清及關節液中DcR3的濃度較OA組明顯升高，且與TNFα的表達呈正相關，但與RA患者的病情活動無明顯的相關性。Hayashi等［14］還用 RT-PCR和 Western blot的方法研究了RA及OA滑膜細胞中DcR3的表達，結果發現OA及RA患者的滑膜細胞中均表達DcR3，其表達量在兩者沒有明顯的差異。作者進一步將DcR3融合蛋白與滑膜細胞共孵育并將DcR3 siRNA轉染至滑膜細胞，結果發現將DcR3融合蛋白抑制了RA滑膜細胞Fas誘導的凋亡作用，但用siRNA沉默DcR3的表達后這種抑制作用明顯減弱，而OA滑膜細胞沒有該表現。我們前期的實驗也已經通過ELISA的方法和熒光實時定量PCR的方法研究了RA患者DcR3在血清水平和基因水平與健康人群之間的差異［15］。研究發現DcR3在RA患者血清中表達的平均水平較健康對照組明顯升高，但RA組各樣本之間的差異較大，結合患者的DAS28評分比較顯示，血清DcR3的表達水平可能與類風濕關節炎疾病活動有一定的相關性。而熒光實時定量PCR也發現在基因水平，RA組外周血單核細胞DcR3的表達水平較健康對照組明顯升高，但與RA病情活動沒有明顯關系。

那么RA患者滑膜組織中是否能夠檢測到DcR3的表達呢?其表達特點是否也與血清中的表達特點一樣與患者的病情活動度相關呢?在本文中，我們進一步運用免疫組織化學的方法研究了RA患者滑膜組織中DcR3的表達，并與OA患者及正常滑膜組織對照。研究發現RA患者滑膜組織中DcR3的表達量明顯增高，并且與滑膜組織的炎性程度成正相關。同時我們運用ELISA的方法檢測了關節液中DcR3蛋白的表達，也發現RA患者關節液中DcR3的表達量同樣高于OA患者。以上提示我們RA患者滑膜組織DcR3的過度表達可能與RA滑膜炎的發病有一定的關系。但其是通過哪種通道來實現的，還有待于進一步研究。

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