重組腺病毒Ad-hBNP對慢性心衰大鼠心肌細胞凋亡因子及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的影響*

宋衍秋 趙莉莉 毛用敏 趙鴻銘 崔讓莊

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）的病理機制為多種原因造成的心室功能減弱，心排出量下降，致心臟前后負荷增加。病變過程中伴隨著交感神經系統、腎素-血管緊張素系統及神經內分泌-細胞因子系統的激活，并伴隨著心肌細胞凋亡及心室重塑。B型利鈉肽 （B-type natriuretic peptide，BNP）為左心室肌細胞合成并分泌的一種肽類激素，其主要作用是利鈉利尿、擴張靜脈、抑制交感神經系統興奮性及拮抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統活性，滿足了作為治療心力衰竭藥物的多項要求，對治療CHF具有重要的臨床應用價值。本實驗應用基因重組腺病毒Ad-hBNP腹腔注射CHF大鼠，觀察其對CHF大鼠心肌細胞凋亡因子及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的影響。

Table 1 The PCR primers and conditions of different genes表1目的基因PCR反應引物序列及實驗條件

1 材料與方法

1.1 建立CHF大鼠模型 健康Wistar雄性大鼠40只，8周齡，體質量250～300 g，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號：SCXK-（軍）2007-004。隨機分為正常對照組（10只），假手術組（10只）及模型組（20只）。實驗動物適應飼養環境1周后。采用腹主動脈縮窄術法建立CHF大鼠模型。模型組術前禁食，僅給予5%葡萄糖溶液8 h，自由飲用，0.4%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹部正中切口，鈍性分離腹主動脈，于右腎動脈分支處上方0.5 cm將腹主動脈挑起，平行放置6號鈍針頭（直徑0.6 mm），結扎，抽出針頭，使腹主動脈部分縮窄，狹窄處直徑為0.6 mm，確認無出血后，關閉腹腔。假手術組于右腎動脈分支上方0.5 cm處挑起腹主動脈后，只穿線不結扎，余同模型組。術后禁食并予5%葡萄糖溶液12 h，自由飲用，逐漸恢復正常飲食。予以青霉素40萬U連續3 d肌內注射以預防感染。術后12周通過超聲心動圖測定左室舒張末徑 （left ventrieular end diastolic dimension，LVEDD）、左室收縮末徑（left ventricular end systolic dimension，LVESD）、左室射血分數 （left ventrieular ejection fraction，LVEF）、 左室 短軸縮短率 （left ventrieular fractional shortening，LVFS），比較 3組的上述指標，若模型組的指標與假手術組和對照組差異均有統計學意義，證明CHF造模成功，并據此確定CHF入選標準，獲得CHF成模大鼠，用于后續實驗。

1.2 慢性心衰大鼠分組及給藥方法 另選取符合CHF入選標準的CHF成模大鼠30只，隨機分為3組，治療組 （AdhBNP組）14只，空白腺病毒組（Ad-Track組）8只，生理鹽水組 （NS組）8只。Ad-hBNP組予以腹腔注射2.5×1010VP/mL重組腺病毒Ad-hBNP（天津市心血管病研究所）1 mL；Ad-Track組腹腔注射 2.5×1010VP/mL空白腺病毒 Ad-Track 1 mL；NS組腹腔注射生理鹽水 1mL，3組均每周注射1次，共4周。另選取10只腹主動脈縮窄假手術大鼠不予以任何處理，作為假手術組。實驗大鼠于溫度18℃～25℃，濕度40%～60%，12 h明暗交替的環境飼養，予以標準鼠料，自由進食、水。各組動物于給藥4周后行RT-PCR檢測心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA含量。

1.3 RT-PCR法測定心肌組織 Bcl-2、Bax、Caspase-3及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA含量 右側頸動脈插管注射10%KCl 2 mL處死大鼠，使大鼠心臟處于舒張期，迅速剖胸，分離心臟，冰生理鹽水清洗，濾紙吸干，留取部分心肌組織，-80℃保存。RNAiso Plus試劑（大連寶生物工程有限公司）提取心肌組織中總RNA，在逆轉錄酶（Promega）的作用下逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，測定相關因子的mRNA表達水平。PCR擴增目的基因片段的引物購自上海生工生物工程有限公司，以GAPDH為內參照，見表1。

PCR在25μL體系中進行，內含60 mmol/L Tris-HCl 1.0 μL，15 mmol/L （NH4）2SO41.0 μL，200 μmol/L dNTP 0.5 μL，0.4 mmol/L目的基因上下游引物各0.5μL和0.08 mmol/L內參基因上下游引物各0.5μL，1 U Taq DNA聚合酶0.25μL，cDNA1.0μL，補水至25μL。反應條件：95℃預變性5 min；95℃ 變性 30 s，62℃/60℃/58℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，35個循環；72℃延伸7 min。PCR結束后2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，拍照，凝膠成像分析軟件測定電泳帶的灰度，用目的基因與內參基因電泳條帶的灰度比值表示目的基因的相對含量。

1.4 統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料采用均數±標準差（±s）表示。對計量資料先行正態性檢驗，符合正態分布的計量資料組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 建立CHF大鼠模型 CHF模型組大鼠20只，存活14只，與正常對照組及假手術組比較，模型組大鼠LVEDD及LVESD均增大，LVEF及LVFS均降低（P<0.01），見表2。可見采用腹主動脈縮窄術法能夠建立CHF大鼠模型。為確保下一步動物實驗研究的可靠性，制定CHF大鼠的入選標準：LVESD>3.2 mm，LVEDD>6.5 mm，LVEF<0.75，LVFS<40%。

Table 2 Results of echocardiographic measurements in three groups表2 各組大鼠超聲心動圖檢測結果 （±s）

Table 2 Results of echocardiographic measurements in three groups表2 各組大鼠超聲心動圖檢測結果 （±s）

*P<0.05，**P<0.01

?

2.2 心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA含量 Ad-hBNP組Bcl-2 mRNA表達較Ad-Track組及NS組升高，差異有統計學意義；AdhBNP組、Ad-Track組及NS組的Bax mRNA表達較假手術組升高，差異有統計學意義；Ad-hBNP組Caspase-3 mRNA表達均較Ad-Track組、NS組及假手術組升高，差異有統計學意義。Ad-hBNP組Ⅰ型膠原mRNA表達較Ad-Track組及NS組降低，差異有統計學意義；Ad-hBNP組Ⅲ型膠原mRNA表達較Ad-Track組降低，差異有統計學意義；Ad-Track組與NS組間Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達差異無統計學意義，見表3。

Table 3 The expression of Bcl-2,Bax,Caspase-3 and collagen type I&III mRNA in cardiac myocytes of different groups of rats表3 各組大鼠心肌Bcl-2、Bax、Caspase-3及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達 （±s）

*P<0.05，**P<0.01

?

3 討論

既往認為心力衰竭致病的分子基礎是心肌細胞收縮蛋白異常和肌漿網鈣攝取紊亂[1]，然而隨著對心力衰竭研究的不斷深入，諸多研究充分證實心室重構在心力衰竭的發生發展中具有十分重要的作用[2]。心肌細胞凋亡和心肌間質Ⅰ、Ⅲ型膠原的沉積在心室重構中具有重要的作用。細胞凋亡與其相關基因的表達和調節有關，其中 Bax、Bcl-2及Caspase-3是調控凋亡信號途徑的重要基因。

本研究發現連續4周Ad-hBNP治療后，CHF大鼠心肌細胞Bcl-2 mRNA表達較Ad-Track及NS組升高，Bax mRNA表達較Ad-Track及NS組有下降趨勢，但差異無統計學意義；Caspase-3 mRNA表達較Ad-Track及NS組均升高。提示BNP對心肌細胞的凋亡具有雙重作用。體內實驗中，BNP能通過抑制線粒體膜通透性轉換孔的開放使心肌細胞免于凋亡和損傷[3]。一些文獻也報道不同濃度的BNP對心肌細胞的凋亡具有雙重作用，低濃度BNP通過環磷酸鳥苷 （cGMP）途徑促進細胞增殖；高濃度的BNP通過非cGMP途徑抑制細胞增殖。在急性心肌梗死模型中，短時間地應用低劑量的外源性BNP（0.001～0.01 μg·kg-1·min-1）通過一氧化氮合酶信號通路抑制心肌細胞凋亡來限制心肌梗死面積[4]。兔缺血再灌注模型中，BNP能通過抑制Caspase-3活化和心肌細胞凋亡預防心肌缺血再灌注損傷[5]。然而，D’Souza等[6]證實BNP可影響心肌的重塑。心肌梗死后心肌BNP表達持續增高，持續增高的BNP可抑制成纖維細胞活性和促心肌細胞凋亡，可能是高濃度BNP對細胞增殖的反向調節。BNP具有促凋亡和抑凋亡的雙重特性，可能與其實驗條件、外源性腦鈉素劑量及使用時間等有關。另外，機械牽拉可誘導心肌細胞凋亡，BNP的生理作用能對抗機械牽拉誘導的細胞凋亡，而在體外培養的心肌細胞中這種作用消失，或許可以解釋BNP對體外培養的心肌細胞具有促凋亡的作用，而對在體研究的心肌細胞則呈雙向作用這一矛盾現象，其機制有待進一步深入研究。

心肌細胞外基質主要由膠原蛋白和纖維連接蛋白等共同形成的一個相互連接的復雜三維網絡結構，其主要成分是Ⅰ、Ⅲ型膠原。近年來研究發現，心肌細胞外基質對于維持心臟正常的結構、心肌間力的正常傳導及心肌舒縮協調性等具有重要意義。當心肌組織發生病理性變化而出現凋亡或壞死，由于心肌細胞屬于終末細胞，不具有再生能力，病變部位的組織將由細胞外基質充填，此時膠原蛋白的生成將會增加，改變了心肌組織正常的結構和功能。本研究發現重組腺病毒Ad-hBNP連續治療CHF大鼠4周后其Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達均低于Ad-Track組。原因可能是外源性BNP對心肌細胞凋亡調控基因的影響，從而使膠原蛋白的生成趨于正常。

綜上所述，外源基因hBNP能影響CHF大鼠心肌細胞凋亡相關基因的表達，減少心肌細胞間質Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達。

[1]Hasenfuss G,Reinecke H,Studer R,etal.Calcium cycling proteins and force-frequency relationship in heart failure[J].Basic Res Cardiol,1996,91(Suppl 2):17-22.

[2]Mann DL.Basic mechanisms of left ventricular remodeling:the contribution of wall stress[J].JCard Fail,2004,10(6 Suppl):S202-206.

[3]Sun Y,Deng T,Lu N,etal.B-type natriuretic peptide protects cardiomyocytes at reperfusion via mitochondrial calcium uniporter[J].Biomed Pharmacother,2010,64(3):170-176.

[4]Ren B,Shen Y,Shao H,etal.Brain natriuretic peptide limits myocardial infarct size dependent of nitric oxide synthase in rats[J].Clin Chim Acta,2007,377(1-2):83-87.

[5]Wu B,Jiang H,Lin R,etal.Pretreatment with B-type natriuretic peptide protects the heart from ischemia-reperfusion injury by inhibiting myocardial apoptosis[J].Tohoku J Exp Med,2009,219(2):107-114.

[6]D’Souza SP,Yellon DM,Martin C,etal.B-type natriuretic peptide limits infarct size in rat isolated hearts via KATP channel opening[J].Am JPhysiol Heart Circ Physiol,2003,284(5):H1 592-600.