選擇性富集分離虎杖中白藜蘆醇苷的分子印跡聚合物的制備及分子識別性能研究

向海艷，范銀洲，李 曼，卓冬梅，謝 揚*

(1.南方醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510515;2.南方醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515)

分子印跡聚合物(Molecularly impriting polymer，MIP)是近年發(fā)展起來的對特定目標分子(即模板分子)具有高度親和性的聚合物材料，是一種人工合成的具有分子識別功能的介質(zhì)。在聚合物制備過程中，待分析檢測的分子(目標分子)通過離子鍵、氫鍵等作用確定分子印跡聚合物基質(zhì)孔穴的形狀、大小以及聚合物功能基團取向，使聚合物分子結(jié)構(gòu)中有許多作用位點，對目標分子保持特殊的“記憶”，從而具有預(yù)定識別的高度選擇性。與傳統(tǒng)生物化學(xué)識別體系相比，MIP具有專一性高、制備簡單、穩(wěn)定性好、可重復(fù)使用等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于樣品前處理、固相萃取、色譜分析、傳感器等領(lǐng)域［1－7］。近年來以天然活性成分為模板分子，制備分子印跡聚合物并將其應(yīng)用于中藥(如長春堿［8］、青蒿素［9］、甘草酸［10］、吲哚生物堿［11］等)提取物分離分析方面的文獻報道不斷增多，但尚未見白藜蘆醇苷分子印跡聚合物的相關(guān)報道。

白藜蘆醇苷(Polydatin，POL)，又稱虎杖甙，即3，4'，5-三羥基芪3-O-β-D葡萄糖苷(3，4'，5-Trihydroxystilbene-3-β-D-glucopyranoside)，為羥基二苯乙烯類化合物，亦是芪類化合物，是從我國傳統(tǒng)中藥虎杖中分離得到的化學(xué)成分，具有明顯的抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗高血脂癥、抗脂質(zhì)過氧化、抗血栓形成等多種活性［12－14］。白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的活性相似，均為虎杖芪類成分中的主要活性成分。白藜蘆醇苷在腸道中糖苷酶的作用下可釋放出白藜蘆醇。

本課題組曾以白藜蘆醇為模板分子制備分子印跡聚合物，研究其結(jié)合選擇性能并用于虎杖提取液中白藜蘆醇的分離純化，效果良好［15］。在虎杖提取物中，白藜蘆醇苷的含量遠遠高于白藜蘆醇，為進一步揭示分子印跡聚合物的分子識別效應(yīng)，本實驗以白藜蘆醇苷為模板分子，通過選擇不同的功能單體，采用本體聚合法制備分子印跡聚合物，研究分子印跡聚合物的分子識別性能，并將其應(yīng)用于虎杖提取物中白藜蘆醇苷的固相萃取分離，為分子印跡聚合物在中藥復(fù)雜樣品中的研究及應(yīng)用提供了一定的實驗基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TU－1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器、DF－101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、201升降恒溫水浴鍋、DZF6010真空干燥箱、TG－16G型冷凍離心機(鞏義市予華儀器有限公司);DHG－9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海浦東豐科學(xué)儀器有限公司);JA2003型電子天平(上海上天精密儀器有限公司)。

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.，廣州中藥材公司);白藜蘆醇苷(POL，中國藥品生物制品鑒定所);白藜蘆醇(RES，Sigma公司 );4-乙烯基吡啶(4-VP，Sigma公司)、甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸(MAA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)均購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;偶氮二異丁腈(AIBN，上海試四赫維化工有限公司)，使用前用甲醇重結(jié)晶;雙酚 A(BPA)、丙烯酰胺(AM)、四氫呋喃(THF)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、甲醇均為分析純試劑;實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 分子印跡聚合物的制備

聚合物的合成采用本體聚合方法，以POL為模板分子，分別以AM、4-VP、HEMA、MAA為功能單體，AIBN為引發(fā)劑進行自由基引發(fā)聚合。稱取0.195 g(0.5 mmol)POL和3 mmol功能單體充分溶解于3 mL THF或DMF中，于安培瓶中超聲10 min后，放置3 h，使模板分子與功能單體充分發(fā)生作用，再加入3 g(15 mmol)交聯(lián)劑EGDMA和0.033 g引發(fā)劑AIBN，充分混溶后，通N2脫氧10 min，在真空狀態(tài)下密封。將密封好的安培瓶于60℃下聚合24 h，所得的棒狀聚合物用研缽磨碎并過75 μm孔篩，用10%(體積分數(shù))乙酸的甲醇溶液置于索氏提取器中提取，除去模板分子及未反應(yīng)的化合物，直至萃取液中檢測不到模板分子。然后用乙醇洗滌除去殘留的乙酸，聚合物顆粒經(jīng)丙酮反復(fù)沉降，除去細粒后，60℃下真空干燥至恒重，即為白藜蘆醇苷分子印跡聚合物MIPs。

除不加模板分子POL外，其余步驟同上制備非分子印跡聚合物NIPs。

1.3 結(jié)合實驗

稱取40 mg聚合物于離心管中，向其中加入4 mL 0.2 mmol/L的POL乙腈溶液后，于室溫下振蕩12 h，將振蕩后的樣品高速離心后移取出上層清液，用乙腈稀釋至一定倍數(shù)后，用紫外可見分光光度計于305 nm處測定其中游離POL的濃度，根據(jù)吸附前后底物溶液濃度的變化，計算印跡聚合物的平衡吸附量Q(μmol/g)。

1.4 選擇性實驗

分別以POL、RES、BPA為底物，在0.2 mmol/L的乙腈溶液中進行平衡吸附實驗，用紫外－可見分光光度計分別測定上清液中各底物的濃度。根據(jù)結(jié)合前后底物的濃度變化，計算印跡聚合物對各底物的平衡吸附量Q。

1.5 固相萃取小柱的制備及虎杖提取液的制備

取兩支SPE商品柱，倒空其中的吸附劑，分別加入500 mg干燥的MIP1和NIP1，蓋緊篩板，用10 mL甲醇平衡。稱取1 g虎杖粗粉，加入100 mL 80%乙醇回流提取2 h，過濾，濾液減壓濃縮至干，用甲醇溶解，取上清液，即得虎杖提取液。

1.6 分子印跡固相萃取分離虎杖提取物中的POL

取1 mL虎杖提取液上樣于填充有MIP1和NIP1的SPE柱中，依次用5 mL甲醇淋洗、5 mL甲醇－冰醋酸(9∶1，體積比)洗脫，流速為0.2 mL/min。流出液收集后用氮氣吹干，殘留物用流動相溶解后進行HPLC分析。色譜條件:色譜柱為Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈－水(23∶77)，進樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min，檢測波長為303 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 MIP的制備

由于氫鍵是聚合中配合物形成的主要作用力，因此需要考慮溶劑對模板分子與功能單體形成氫鍵的影響。采用乙腈為溶劑制備白藜蘆醇分子印跡聚合物，但實驗發(fā)現(xiàn)，由于POL含有多個酚羥基以及葡萄糖基，具有較大的極性，使得其在乙腈中的溶解性有限，無法以乙腈為溶劑進行本體聚合;雖然POL在甲醇中的溶解性優(yōu)于在乙腈中的溶解性，但甲醇是質(zhì)子型極性溶劑，會干擾模板分子與功能單體的氫鍵作用;經(jīng)反復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)，POL在THF中有較好的溶解性，可用于聚合反應(yīng)。

為考察不同的功能單體對聚合物識別性能的影響，實驗分別以堿性4-VP、中性HEMA、丙烯酰胺以及酸性MAA為功能單體，制備分子印跡聚合物，除4-VP因在THF中不能完全溶解而選擇以DMF為溶劑外，其余聚合物均以THF為溶劑進行聚合，分子印跡聚合物的聚合條件見表1。

2.2 分子印跡聚合物的吸附特性及選擇性

使用靜態(tài)平衡結(jié)合法，考察了4種聚合物在4 mL 0.2 mmol/L的POL乙腈溶液中的結(jié)合量。同時，選擇與POL分子結(jié)構(gòu)相似的RES和BPA為底物(分子結(jié)構(gòu)如圖1所示)，考察了印跡聚合物對結(jié)構(gòu)類似物的結(jié)合量，實驗結(jié)果見表2。從表中可以看出，分子印跡聚合物對模板分子的結(jié)合量大于非印跡聚合物，并且印跡聚合物對模板分子的結(jié)合量大于其對結(jié)構(gòu)類似物的結(jié)合量。為進一步說明印跡聚合物的印跡效應(yīng)，引用兩個參數(shù)α和ε［16］，其中α為模板分子在MIP上的結(jié)合量與模板分子在NIP上的結(jié)合量之比，用以表征MIP中存在印跡孔穴，α值越大，印跡效應(yīng)越好;ε是MIP對模板分子的結(jié)合量與MIP對結(jié)構(gòu)類似物的結(jié)合量之比，用以表征MIP中印跡孔穴對模板分子的選擇性，ε值越大，聚合物的選擇性越好。從表2可以看出，4種印跡聚合物都有較大的α值，表明在印跡聚合物中存在印跡孔穴，因此相對于非印跡聚合物對模板分子的吸附量要大;同時，4種聚合物的ε值均大于1，表明印跡聚合物中的印跡孔穴對模板分子具有選擇性。

圖1 POL、RES、BPA的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structures of POL，RES and BPA

通過進一步比較發(fā)現(xiàn)，4種印跡聚合物對模板分子的結(jié)合量大小順序為:MIP1＞MIP2＞MIP3＞MIP4，α值及ε值也有相似的規(guī)律，表明以AM為功能單體所得MIP1對模板分子的吸附量及選擇性最好，其次是以4-VP為功能單體所得的 MIP2，以HEMA和MAA為功能單體的MIP3和MIP4的吸附量及選擇性較差。從白藜蘆醇的結(jié)構(gòu)可以看出，與功能單體發(fā)生相互作用的基團主要是酚羥基。研究表明，在極性溶劑中酰胺比羧酸能形成更強的氫鍵［17］。4-VP呈弱堿性，與POL之間除了氫鍵作用力外，還有離子鍵作用力，但由于在DMF溶劑中聚合，部分削弱了氫鍵作用力;MAA呈酸性，與酚羥基作用力最弱，所以識別能力最差，說明功能單體與模板分子之間的相互作用力強弱對MIP的識別能力有較大的影響。功能單體與模板分子的相互作用力越強，所合成出的分子印跡聚合物對模板分子的識別性能越好，反之亦然。

表2 聚合物對POL、RES及BPA的結(jié)合能力Table 2 Binding capabilities of imprinted polymers to POL，RES and BPA

圖2 分子印跡聚合物及非分子印跡聚合物的吸附等溫線Fig.2 Adsorption isotherms of MIP1 and NIP1

2.3 分子印跡聚合物吸附等溫線及Scatchard分析

上述實驗表明，MIP1具有最好的結(jié)合性能和選擇性能，為了進一步研究MIP1的吸附特性，使用靜態(tài)平衡結(jié)合法，分別測定MIP1及NIP1對不同濃度POL的結(jié)合量，以Q對C0作圖，得到MIP1及NIP1對POL的吸附等溫線，如圖2所示。從圖2可知，MIP1對模板分子的吸附量大于NIP1對模板分子的吸附量。表明與化學(xué)組成相同的相應(yīng)非模板聚合物相比，MIP1對POL有較大的吸附性能和高度的選擇性。這種分子識別特性來自于該聚合物的結(jié)合基團與模板分子的功能基之間的氫鍵作用和空穴的幾何選擇性。

進一步采用Scatchard模型評價分子印跡聚合物的結(jié)合特性，Scatchard方程如下:Q/C=(Qmax－Q)/Kd，其中，Kd為結(jié)合位點的平衡離解常數(shù)，Qmax代表結(jié)合位點的最大結(jié)合量，C表示底物在上清液中的平衡濃度。以Q/C對Q作圖，可以得到聚合物的平衡離解常數(shù)Kd及最大表觀結(jié)合位點數(shù)Qmax。對上述吸附實驗結(jié)果進行Scatchard分析，結(jié)果如圖3所示。從圖3看出，Scatchard曲線分為兩段，2條不同斜率的直線分別呈現(xiàn)良好的線性，說明在所研究的模板分子濃度范圍內(nèi)，聚合物主要形成2種不同的結(jié)合位點，即高親和力位點和低親和力位點。由斜率和截距可求出:高親和力結(jié)合位點離解常數(shù)Kd1=7.43×10－5mol/L，飽和結(jié)合位點數(shù) Qmax1=10.40 μmol/g;低親和力結(jié)合位點離解常數(shù) Kd2=3.70×10－3mol/L，飽和結(jié)合位點數(shù) Qmax2=111.93 μmol/g。

圖3 分子印跡聚合物MIP1的Scatchard曲線Fig.3 Scatchard plots of MIP1

2.4 分子印跡聚合物對混合底物的選擇結(jié)合性能

研究了MIP1對白藜蘆醇苷、白藜蘆醇和雙酚A混合底物的選擇結(jié)合性能，結(jié)果見表3。從表3可見，在混合底物中，MIP1對模板分子POL的結(jié)合量大于NIP1對POL的結(jié)合量，且MIP1對模板分子POL的結(jié)合量大于其它兩種結(jié)構(gòu)類似物RES和BPA的結(jié)合量，表明MIP1對模板分子產(chǎn)生了明顯的印跡效應(yīng)，對模板分子POL具有選擇性識別作用。同時，由于RES在結(jié)構(gòu)上與模板分子POL具有相似性，所以MIP1對RES也有較大的結(jié)合量;BPA的結(jié)構(gòu)與POL相差較大，因此MIP1對BPA的結(jié)合量較小，表明結(jié)構(gòu)類似物的結(jié)構(gòu)與模板分子結(jié)構(gòu)差別越大，MIP對模板分子的選擇性識別性能越好。從文獻［15］所報道RES分子印跡聚合物的識別性能也能得到這一結(jié)論。另外，對比表3的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，MIP1對混合底物的吸附量小于對單個底物的吸附量，原因可能是在混合底物中，聚合物的結(jié)合性能受到競爭性吸附的影響。

表3 分子印跡聚合物對POL、RES及BPA混合底物的結(jié)合能力Table 3 Binding capability of molecularly imprinted polymers to mixed substrates of POL，RES and BPA

2.5 分子印跡固相萃取分離虎杖提取物中POL

采用固相萃取小柱對POL標準溶液進行分離。取1.0 mL 0.2 mmol/L的POL甲醇溶液加入柱中，以5 mL甲醇淋洗，5 mL甲醇－冰醋酸(9∶1)洗脫，流速為0.2 mL/min，流出液經(jīng)HPLC分析測定含量，結(jié)果見表4。從表4可見，對于MIP1－SPE柱，在上樣流出液及淋洗液中，POL含量很少，表明大部分POL被萃取柱吸附，而在洗脫液中，POL含量較高，表明被萃取柱吸附的POL可被洗脫液洗脫下來，即MIP1－SPE柱可實現(xiàn)對POL的良好分離。而對于NIP1－SPE柱，POL在淋洗液中即被大部分洗下來，而在洗脫液中的含量很低，表明NIP1－SPE柱對POL不具有選擇性吸附分離效果。

將上述的MIP1－SPE柱用于虎杖提取液中POL的分離。取1.0 mL虎杖提取液上樣于填充有MIP1的SPE柱中。分別對虎杖提取液、上樣流出液以及洗脫液進行HPLC分析，從HPLC圖看出，虎杖提取物中含有POL、RES等成分(見圖4)，通過MIP柱后，POL被吸附，在上樣流出液中未檢測到POL，同時RES也被部分吸附(見圖5A);在甲醇淋洗液中，未檢測到POL的信號(見圖5B)，而在甲醇－冰醋酸(9∶1)的洗脫液中能觀察到POL的色譜峰及少量RES色譜峰(見圖5C)。同樣，將虎杖提取物吸附在NIP1上，幾乎所有成分在甲醇淋洗液中均能檢測到，其色譜圖與虎杖提取物的色譜圖無明顯差異。而在洗脫液中也未檢測到POL，以上結(jié)果說明，MIP1能特異性地吸附虎杖提取物中的POL，可用于虎杖提取物復(fù)雜樣品中POL的分離富集。

表4 POL在上樣流出液、淋洗液及洗脫液中的含量百分比Table 4 Percentages of POL collected from the loading solution，washing solution and eluting solution

圖4 虎杖提取液的色譜圖Fig.4 Chromatogram of the Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.extracts

圖5 上樣流出液(A)、淋洗液(B)及洗脫液(C)的色譜圖Fig.5 Chromatograms of MIP1－SPE loading(A)，washing(B)and eluting(C)solutions

3 結(jié)論

本文以白藜蘆醇苷為模板分子，分別以AM、4-VP、HEMA、MAA為功能單體，EGDMA為交聯(lián)劑，AIBN為引發(fā)劑，采用本體聚合法制備了白藜蘆醇苷分子印跡聚合物，采用靜態(tài)平衡結(jié)合實驗研究了聚合物的識別能力。研究表明，以AM為功能單體合成的聚合物對模板分子的識別性能最好，其次是以4-VP為功能單體合成的MIP2，以HEMA為功能單體的MIP3以及以MAA為功能單體的MIP4的識別性能較差。功能單體與模板分子主要通過離子鍵和氫鍵發(fā)生作用，這種相互作用力的強弱對MIP的識別能力有較大的影響。對聚合物MIP1的吸附特性及選擇性的進一步考察也表明，MIP1分子印跡聚合物對模板分子呈現(xiàn)較好的結(jié)合能力和選擇能力，將MIP1作為固相萃取柱吸附劑，能有效富集分離虎杖提取物中的白藜蘆醇苷。

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