急性白血病細(xì)胞系中SFRP基因啟動(dòng)子甲基化及去甲基化誘導(dǎo)表達(dá)的研究

徐成波， 馮 敏， 廖 斌， 皇甫真萍， 齊 彥， 陳毅寧， 陳佳薇， 沈建箴

(1福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科，福建福州350004;2福建省立醫(yī)院北院，福建省老年醫(yī)院內(nèi)分泌科，福建福州350001;3福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科，福建福州350001)

Wnt信號(hào)通路的過度激活參與了人類多種腫瘤的形成，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生過程中的關(guān)鍵信號(hào)通路。分泌型卷曲相關(guān)蛋白(secreted frizzled-related protein，SFRP)作為Wnt信號(hào)通路的胞外拮抗物，能通過多種機(jī)制抑制經(jīng)典和非經(jīng)典的Wnt通路［1］，阻斷異常激活的Wnt信號(hào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到抑制腫瘤的形成與發(fā)展。為了探討SFRP基因家族啟動(dòng)子CpG島異常甲基化狀態(tài)在急性白血病(acute leukemia，AL)發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究擬采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)的方法檢測(cè)白血病細(xì)胞系和不同濃度的5-氮雜-2’-脫氧胞苷酸(5-aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR)作用下 Jurkat細(xì)胞中 SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化，并檢測(cè) SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5、DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)1、DNMT3A 和 DNMT3B mRNA表達(dá)的變化，以期從表觀遺傳學(xué)水平揭示AL的發(fā)病機(jī)制。

材料和方法

1 材料

實(shí)驗(yàn)用急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)細(xì)胞為Molt-4和 Jurkat細(xì)胞，急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)細(xì)胞為HL-60和NB4細(xì)胞，均由福建省血液病研究所傳代保存。

小牛血清(杭州四季青公司);RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco);5-Aza-CdR、蛋白酶K、RNA酶、亞硫酸氫鈉和氫醌(Sigma);淋巴細(xì)胞分離液和酚-氯仿DNA抽提液(上海生物工程公司);焦碳酸二乙酯(DEPC)和Trizol試劑(上海生物工程公司);Wizard DNA樹酯純化試劑盒(Promega);Platinum? SYBR? Green qPCR SuperMix-UDG試劑盒(Invitrogen);2×Taq PCR Master Mix試劑(北京博邁德生物公司);DNA marker(廈門鷺隆生物有限公司)。引物由Invitrogen合成。

37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱(Heal Force);DU-640紫外分光光度儀(Beckman Coulter);Gel Doc 1000凝膠圖像分析儀(Bio-Rad);7700型PCR擴(kuò)增儀和7500型熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)實(shí)驗(yàn) 所用AL細(xì)胞均常規(guī)復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(pH 7.2)，于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天傳代1次，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。SFRP基因去甲基化實(shí)驗(yàn)中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Jurkat細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，并接種于培養(yǎng)瓶中，未處理組細(xì)胞即不加藥培養(yǎng)72 h作為空白對(duì)照，其余分別加入5-Aza-CdR 1μmol/L、2μmol/L和4μmol/L處理，共培養(yǎng)72 h，用藥結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，進(jìn)行DNA和RNA的提取，用于進(jìn)一步的研究。

2.2 正常人骨髓或外周血單個(gè)核細(xì)胞的提取 骨髓穿刺檢查或抽取外周血時(shí)，留取骨髓標(biāo)本或外周血2 mL，肝素抗凝。在離心管中加入2倍體積的淋巴細(xì)胞分離液，顛倒混勻。將骨髓標(biāo)本或血標(biāo)本離心20 min。離心后，上層為血清，中間層為單個(gè)有核細(xì)胞，下層為紅細(xì)胞和血小板。小心吸取中間層的單個(gè)核細(xì)胞，洗滌離心后備用。

2.3 細(xì)胞基因組DNA的提取 收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞以及正常人骨髓或外周血單個(gè)核細(xì)胞，常規(guī)酚-氯仿法提取細(xì)胞基因組DNA，并通過紫外分光光度儀鑒定其含量及純度。用去離子水溶解后于-20℃保存。

2.4 基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾與純化 參考Herman等［2］的方法并加以改進(jìn)，取1～2μg DNA溶解于50μL去離子水中，加3 mol/L NaOH 5.5μL，37℃水浴30 min。向堿變性的DNA中加入新配置的10 mmol/L氫醌30μL和3 mol/L亞硫酸氫鈉520 μL，以礦物油3滴覆蓋液面，50℃水浴16 h。再用Wizard DNA Clean-Up System純化，純化后的DNA加3 mol/L NaOH 5.5μL，室溫放置15 min，用預(yù)冷的70%乙醇沉淀DNA，并以30μL去離子水溶解，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 MSP檢測(cè) 取經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾后的DNA 3 μL為模板，采用25μL體系進(jìn)行擴(kuò)增，體系包含12.5μL的2×Taq PCR Master Mix，甲基化或非甲基化的上、下游引物各0.5μL，補(bǔ)足水至25μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4 min，95℃ 45 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。同時(shí)，以修飾后的正常人骨髓或外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA為非甲基化陰性對(duì)照，將已經(jīng)證實(shí)均存在 SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因高甲基化的人結(jié)直腸癌細(xì)胞系RKO細(xì)胞DNA為甲基化陽(yáng)性對(duì)照［3］，H2O作空白對(duì)照。將PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠圖像分析儀上自動(dòng)分析成像。應(yīng)用甲基化引物擴(kuò)增出基因甲基化產(chǎn)物的細(xì)胞，定為該基因完全甲基化;應(yīng)用非甲基化引物擴(kuò)增出基因非甲基化產(chǎn)物的細(xì)胞，定為該基因完全非甲基化;同時(shí)可擴(kuò)增出甲基化和非甲基化產(chǎn)物的細(xì)胞，定為該基因部分甲基化。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)SFRP mRNA的表達(dá)水平 各組細(xì)胞至培養(yǎng)終點(diǎn)后以Trizol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA，并鑒定RNA的完整性。以2μg RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時(shí)定量RT-PCR采用7500型熒光定量PCR儀和Platinum? SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參照。采用與GAPDH比較Ct值的方法來定量mRNA表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 半定量RT-PCR檢測(cè)DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA的表達(dá)水平 采用7700型PCR擴(kuò)增儀和2×Taq PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參照，將PCR產(chǎn)物于2.0%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠圖像分析儀上自動(dòng)分析成像，以目的條帶與GAPDH條帶的吸光度比值進(jìn)行半定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AL細(xì)胞系中SFRP基因的甲基化狀態(tài)

在 Molt-4、Jurkat、HL-60 和 NB4 細(xì)胞中，應(yīng)用甲基化引物可擴(kuò)增出的 SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的甲基化產(chǎn)物特異性條帶，同時(shí)應(yīng)用非甲基化引物在HL60細(xì)胞中可擴(kuò)增出SFRP4基因的非甲基化產(chǎn)物，表明 SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因在Molt-4、Jurkat和NB4細(xì)胞中均呈完全甲基化狀態(tài)，而 HL-60細(xì)胞中 SFRP1、SFRP2和SFRP5呈完全甲基化狀態(tài)，而SFRP4基因呈部分甲基化狀態(tài)，見圖1。正常人骨髓或外周血單個(gè)核細(xì)胞應(yīng)用非甲基化引物可擴(kuò)增出SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的非甲基化特異性條帶，而甲基化引物不能擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物，表明正常人細(xì)胞中SFRP基因均呈非甲基化狀態(tài)。

Figure 1.MSP analysis of SFRP1，SFRP2，SFRP4 and SFRP5 genes in Molt-4，Jurkat，HL-60 and NB4 cell lines.M:methylated;U:unmethylated;NC:negative control;PC:positive control;H2 O:blank control.圖1 4種AL細(xì)胞中SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的甲基化分析

2 SFRP2基因甲基化MSP產(chǎn)物的序列分析

為了證實(shí)MSP分析基因甲基化的可靠性，隨機(jī)挑選了SFRP2基因甲基化引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，經(jīng)T-A克隆后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果證明該MSP產(chǎn)物是野生型(wild-type)SFRP2基因啟動(dòng)子區(qū)的部分序列，其分析結(jié)果完全可靠。甲基化的SFRP2基因，其CpG島二核苷酸中的胞嘧啶(C)堿基未被亞硫酸氫鹽硫化改變，仍為C堿基;而在非CpG島中的C堿基經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后都轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶(T)堿基，見圖2。

Figure 2.Sequence analysis of the MSPproduct of methylated SFRP2 gene after bisulfite treatment.Wild-type cytosine(C)residues that were methylated in CpGislands(framed)remained unchanged，and Cresidues that were unmethylated were changed to thymidine(T)by bisulfite-induced deamination(underlined).圖2 SFRP2基因甲基化MSP產(chǎn)物的序列分析

3 Jurkat細(xì)胞經(jīng)5-Aza-Cd R處理后SFRP基因甲基化水平的改變

用不同濃度5-Aza-CdR處理Jurkat細(xì)胞72 h后，MSP分析顯示，隨著5-Aza-CdR濃度的升高，SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的甲基化水平(吸光度值)逐漸降低，見圖3，提示SFRP基因的高甲基化狀態(tài)被逆轉(zhuǎn)。

Figure 3.MSPanalysis of SFRP genes in Jurkat cell line before and after treatment with 5-Aza-CdR for 72 h.圖3 5-Aza-Cd R處理Jurkat細(xì)胞后SFRP基因甲基化水平的變化

4 Jurkat細(xì)胞經(jīng)5-Aza-Cd R處理后SFRP mRNA表達(dá)水平的改變

4 μmol/L 5-Aza-CdR 組中SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5 mRNA表達(dá)水平均明顯升高，分別是未處理組中表達(dá)水平的4.6、3.5、2.3和4.2倍(均P＜0.01)，見圖4，提示SFRP基因的高甲基化狀態(tài)被逆轉(zhuǎn)后，甲基化沉默的SFRP基因被激活轉(zhuǎn)錄。

Figure 4.The mRNA expression levels of SFRP in Jurkat cell line before and after treatment with 5-Aza-CdR at the concentration of 4 μmol/L.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control.圖4 5-Aza-CdR處理Jurkat細(xì)胞72 h后SFRP mRNA表達(dá)水平的變化

5 Jurkat細(xì)胞經(jīng)5-Aza-Cd R處理后DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達(dá)水平的變化

半定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著5-Aza-CdR濃度升高以及SFRP基因甲基化水平的降低，DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA的表達(dá)水平均有下調(diào)，且呈劑量依賴性，各藥物作用組與未處理組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5。

Figure 5.Semiquatitative RT-PCR analysis of DNMT1，DNMT3A and DNMT3B mRNA expression in Jurkat cell line before and after treatment with 5-Aza-CdR for 72 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0μmol/L.圖5 5-Aza-CdR處理Jurkat細(xì)胞后DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達(dá)水平的變化

討 論

DNA甲基化是真核生物基因組最常見的一種表觀遺傳學(xué)修飾方式，它對(duì)X染色體滅活［4］、基因組印跡［5］、DNA 修復(fù)［6］和基因表達(dá)調(diào)控［7］等起著非常重要的作用。基因組特定序列的低甲基化或高甲基化都會(huì)使基因的表達(dá)發(fā)生變化。大約90%的DNA甲基化發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)的CpG島，正常生理?xiàng)l件下絕大部分啟動(dòng)子CpG島均處于非甲基化狀態(tài)，一旦基因的CpG島發(fā)生高甲基化將直接導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄失活。

Wnt信號(hào)通路調(diào)控著細(xì)胞的增殖、分化、極化、凋亡與抗凋亡等許多生命過程［8］。研究表明，Wnt異常信號(hào)通路激活癌癥的重要機(jī)制是一種或多種可溶性Wnt抑制基因的甲基化沉默所致，SFRP作為Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，其基因表達(dá)下調(diào)可引起Wnt信號(hào)通路持續(xù)異常激活，從而最終引起包括胃腸道腫瘤、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌及間皮瘤等腫瘤的發(fā)生，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生過程中的關(guān)鍵信號(hào)通路［9］。

SFRP作為Wnt信號(hào)途徑的“門戶”，在正常情況下能有效地抑制Wnt途徑的異常激活。但是，在SFRP基因發(fā)生甲基化沉默后則失去這種作用［10］。Chim等［11］利用骨髓瘤細(xì)胞株及原發(fā)性骨髓瘤標(biāo)本研究Wnt信號(hào)通路的激活情況，發(fā)現(xiàn)在4組細(xì)胞株中，LP1及WL2細(xì)胞株存在Wnt信號(hào)的異常激活，且與多種Wnt抑制基因超甲基化沉默有關(guān)，去甲基化后抑制基因可重新恢復(fù)表達(dá)，Wnt通路活化水平也開始下調(diào)。同時(shí)，在初發(fā)多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者中，有42%的患者存在至少一種抑制基因的甲基化，其中61.9%有2種以上抑制基因的甲基化。Jost等［12］對(duì)76例初治MM患者的SFRP基因進(jìn)行甲基化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有35.5%的 SFRP1、52.6%的SFRP2、1.3%的SFRP4和6.9%的SFRP5存在高甲基化，而且SFRP5的高甲基化可能與疾病的進(jìn)展有關(guān)。Liu等［13］在對(duì)20例慢性B淋巴細(xì)胞白血病患者的研究中發(fā)現(xiàn)，SFRP基因普遍存在DNA甲基化沉默，SFRP1、SFRP2和SFRP5基因基因的甲基化比率分別是100%、55%、30%和15%。

本研究應(yīng)用 MSP技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SFRP1、SFRP2、SFRP4 和 SFRP5 基因在 Molt-4、Jurkat和NB4細(xì)胞中均呈完全甲基化狀態(tài)，而HL-60細(xì)胞中SFRP1、SFRP2和SFRP5基因呈完全甲基化狀態(tài)，SFRP4基因呈部分甲基化狀態(tài)，因此推測(cè)，SFRP基因在AL中發(fā)生高頻率甲基化。

白血病的DNA去甲基化治療已成為AL治療研究的新熱點(diǎn)［14］。去甲基化藥物5-Aza-CdR是美國(guó)FDA批準(zhǔn)的第一批用于治療MDS的表觀遺傳藥物。5-Aza-CdR過去主要作為抗腫瘤細(xì)胞毒藥物使用，阻斷細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR作用Jurkat細(xì)胞72 h后，隨著藥物終濃度的增加，SFRP mRNA的表達(dá)水平隨著甲基化程度的降低而增高，這表明SFRP基因去甲基化后重新恢復(fù)表達(dá)。與此同時(shí)，DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達(dá)水平也呈劑量依賴性的表達(dá)下調(diào)。由于5-Aza-CdR是核苷類似物，磷酸化后能與DNMT形成共價(jià)復(fù)合物，抑制其與DNA結(jié)合發(fā)揮甲基化活性，從而誘導(dǎo)DNA去甲基化［15］。因此，推測(cè)5-Aza-CdR可能通過抑制DNMT表達(dá)，阻斷DNMT轉(zhuǎn)移S-腺苷蛋氨酸的甲基于CpG島的5-胞嘧啶上而逆轉(zhuǎn)DNA啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化，重新激活因高甲基化而處于沉默的SFRP基因，而達(dá)到去甲基化激活轉(zhuǎn)錄的作用。但是由于5-Aza-CdR對(duì)基因的去甲基化作用缺乏細(xì)胞特異性，它在治療異常甲基化的同時(shí)，可能會(huì)引起處于抑制狀態(tài)的某些基因恢復(fù)活性，導(dǎo)致正常基因調(diào)控機(jī)制的紊亂，所以5-Aza-CdR廣泛應(yīng)用于臨床還需要進(jìn)一步的探索。