肥大細胞Toll樣受體4在人慢性牙周炎牙齦組織中的表達*

藍 田， 呂芳麗， 李 娟， 陸達明， 黃 博， 黃世光△

(1暨南大學醫學院口腔醫學系，廣東廣州510632;2中山大學醫學院寄生蟲教研室，廣東廣州510080)

傳統認為肥大細胞主要參與IgE介導的過敏反應，肥大細胞作為效應和調節性免疫細胞在固有免疫的建立和適應性免疫反應的調節中發揮重要作用近年來受到了重視［1-2］。然而，肥大細胞在牙周炎免疫病理中的作用一直為人們所忽視。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類識別病原相關分子模式的識別受體(pathogen-associated molecule patterns，PMAPs)，在固有免疫防御中起重要作用［3］。TLR4作為Toll樣受體家族的重要成員，是革蘭氏陰性菌細胞壁脂多糖成分的天然受體分子。我們在前期的研究中報道了人慢性牙周炎牙齦組織中肥大細胞的表達不僅數量顯著增加，并見明顯脫顆粒現象，提示肥大細胞的募集和脫顆粒可能參與宿主牙周感染免疫反應的病理過程［4-5］。然而，關于肥大細胞TLRs與牙周炎關系尚未見報道。本實驗通過免疫熒光雙染色的方法觀察不同病變程度牙周炎牙齦組織及肥大細胞上TLR4的表達情況，分析肥大細胞TLR4與牙周炎癥程度的相關性，探討肥大細胞TLR4在牙周炎發病中的可能作用。

材料和方法

1 研究對象

1.1 牙周炎病例選擇 選擇2010年～2012年在暨南大學荔灣口腔教學醫院牙周科門診就診的自愿接受本研究的牙周炎患者，年齡為25～65歲，其中男性37名(47歲±12歲)，女性31名(43歲±12歲)，各實驗組在年齡、性別上差異無統計學意義。受試者均無糖尿病和其它系統疾病;6個月內無服用抗生素藥物治療;無食物、藥物過敏史;非孕婦或服用避孕藥的婦女;1年內沒有進行牙周手術治療。納入標準依據美國牙周病學會1999年的牙周病新分類指南［6］;所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 分組 (1)正常對照組:無牙周袋，無附著喪失，X線片顯示無牙槽骨吸收，牙齦無炎癥;(2)輕度牙周炎組:牙齦有炎癥，探針出血，牙周袋≤4 mm，附著喪失≤2 mm，X線片顯示牙槽骨吸收不超過根長的1/3，可有或無口臭;(3)重度牙周炎組:牙周袋＞6 mm，附著喪失≥5 mm，X線片顯示牙槽骨吸收超過根長的1/2，甚至達根長的2/3，多根牙有根分叉病變，牙齒多有松動，牙齦炎癥明顯或發生牙周膿腫。

1.3 取材 輕度牙周炎組23例，為需要接受臨床牙冠延長術者;重度牙周炎組25例，取自無保留價值或預后極差的重度牙周炎需要拔除者;正常對照組20例，取自因正畸治療需要拔除的牙周健康的前磨牙。

2 方法

2.1 組織標本采集、處理與觀察 牙齦組織標本于4%中性甲醛液中固定48 h以上，制成頰舌向5μm厚度連續切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察牙齦組織學改變。由2名病理醫師盲法觀察，并對牙齦組織的炎癥細胞浸潤情況進行評分，求其平均值。炎癥程度評分標準參照Huang等［7］的方法:0:無炎癥細胞浸潤;1:輕度炎癥，炎癥細胞局部呈小灶狀浸潤;2:中度炎癥，炎癥細胞呈灶狀及片狀浸潤;3:重度炎癥，炎癥細胞在牙齦組織內呈彌漫性浸潤。

2.2 TLR4免疫組織化學SP法染色及結果處理 免疫組化染色:采用免疫組織化學SP法對牙齦組織切片進行染色，Ⅰ抗TLR4(武漢博士德)，稀釋濃度為1∶100。采用SP法(試劑盒為 PV9002，北京中杉金橋生物技術有限公司)染色、DAB(DAB染色試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司)顯色劑顯色，陰性對照采用PBS緩沖液代替I抗，蘇木素復染。組織化學法染色陽性信號為棕黃色細小顆粒，定位于細胞核或細胞漿。對每個切片標本中陽性細胞進行記數。每個切片記數5個400倍視野下總細胞數及陽性細胞數，計算陽性細胞比例(%)，取其平均值。

2.3 肥大細胞和TLR4免疫熒光雙染色法及結果處理 采用免疫熒光雙染色法對牙齦組織切片進行染色。Ⅰ抗:tryptase抗體(Abcam)，稀釋濃度為1∶200;TLR4抗體(武漢博士德)，稀釋濃度為1∶100。Ⅱ抗:山羊抗鼠IgG(H+L)Alex Flour? 555和山羊抗兔IgG(H+L)Alex Flour?488(Cell Signaling Technology)，稀釋濃度為1∶200。免疫熒光陽性信號為肥大細胞表達綠色熒光，TLR4表達紅色熒光，定位于細胞核或細胞漿，同一視野肥大細胞與TLR4重疊后為黃色熒光。染色切片由2名病理醫師于免疫熒光顯微鏡觀察表達TLR4的肥大細胞數量，取其平均值。每張切片在高倍視野(×400)下選取黃色熒光細胞數目最多的5個視野進行計數，計算5個視野中表達TLR4的肥大細胞的總數。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統計軟件分析。牙齦組織炎癥程度評分的組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗;牙齦組織TLR4陽性細胞比例和TLR4陽性肥大細胞數量的組間比較采用完全隨機設計的單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 組織學分析

牙齦組織的組織學改變見圖1，正常對照組未見炎癥細胞浸潤(圖1A);輕度牙周炎組見少量散在炎癥細胞浸潤(圖1B);重度牙周炎組有明顯的炎性細胞浸潤，出現大范圍的淋巴細胞、漿細胞和肥大細胞浸潤，可見散在分布的巨噬細胞樣細胞及多形核細胞(圖1C)。重度牙周炎組炎癥程度評分明顯高于輕度牙周炎組(P＜0.05)。

Figure 1.Histological changes of human gingival tissues(HE staining，× 400)and their scores of inflammation.A:healthy control group(n=20);B:mild chronic periodontitis group(n=23);C:severe chronic periodontitis group(n=25).Mean±SD.*P＜0.05 vs A;#P＜0.05 vs B.圖1 各組牙齦組織的組織學變化和炎癥程度評分

2 牙齦組織TLR4免疫組織化學染色結果

牙齦組織TLR4免疫組化染色結果見圖2，正常對照組牙齦組織可見散在分布數量較少的TLR4表達(圖2A);輕度牙周炎組牙齦組織中TLR4陽性細胞數明顯增加(圖2B);重度牙周炎組牙齦組織見大量的TLR4表達(圖2C)。與正常對照組相比較，牙周炎組的TLR4明顯上升(P＜0.05);重度牙周炎組的TLR4陽性細胞比例顯著高于輕度牙周炎組(P＜0.05)。

Figure 2.Expression of TLR4 in human gingival tissues(immunohistochemical staining，×400).A:healthy control group(n=20);B:mild chronic periodontitis group(n=23);C:severe chronic periodontitis group(n=25).Mean±SD.*P＜0.05 vs A;#P＜0.05 vs B.圖2 免疫組織化學染色檢測各組牙齦組織中TLR4的表達

3 肥大細胞和TLR4免疫熒光雙染色結果

各組牙齦組織肥大細胞和TLR4免疫熒光雙染色結果見圖3。正常對照組牙周組織中可見小量散在分布的肥大細胞和TLR4陽性表達的肥大細胞(圖3A);輕度牙周炎組牙齦組織中肥大細胞數和TLR4陽性肥大細胞數明顯增加(圖3B);重度牙周炎組牙齦組織中見大量的肥大細胞和TLR4陽性肥大細胞(圖3C)。與正常對照組相比，牙周炎組TLR4陽性表達的肥大細胞數量明顯上升(P＜0.05);重度牙周炎組TLR4陽性表達的肥大細胞的數量顯著多于輕度牙周炎組(P＜0.05)。

Figure 3.Expression of TLR4 on mast cells in human gingival tissues(immunofluorescet staining， × 400).A:healthy control group(n=20);B:mild chronic periodontitis group(n=23);C:severe chronic periodontitis group(n=25).Mean±SD.*P＜0.05 vs A;#P＜0.05 vs B.圖3 免疫熒光染色檢測各組牙齦組織中肥大細胞TLR4的表達

討 論

Toll樣受體是一類廣泛存在于哺乳動物細胞內的生物模式識別受體，能夠識別各種微生物表面的高度保守結構，如細菌脂多糖、肽聚糖、脂蛋白、細菌DNA、雙鏈 RNA等。TLRs信號通過上調抗原提呈細胞(antigen-presenting cell，APC)表面的共刺激分子及APC分泌的炎癥細胞因子，誘導T、B淋巴細胞向效應 T、B淋巴細胞分化，調節適應性免疫反應［8-9］。研究發現中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞及單核細胞均表達TLRs，可識別不同的病原體，并在病原體入侵時快速激活固有免疫，引起炎癥反應，殺滅入侵的病原體［10］。TLR4是Toll樣受體家族中最早被發現的成員之一，主要識別革蘭氏陰性菌細胞壁脂多糖結構［11］。牙周病主要是革蘭氏陰性厭養菌如牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)等對牙周組織所致慢性病理損害的結果。研究顯示，牙周炎患者牙周組織中TLR2、3、4和9的表達均高于牙周健康者［12-13］，其中TLR2基因多態性與日本人群侵襲性牙周炎密切相關［14］，而TLR2和TLR4在血脂異常性牙槽骨破骨細胞分化中起著重要作用［15］。在牙周炎組織中，研究發現TLR4主要表達于結締組織中;而在牙周炎患者臨床相對健康的牙齦組織和健康牙齦組織中，未發現TLR4的表達，提示TLR4參與了牙周炎的免疫過程［16］。研究還顯示TLR4在人牙齦成纖維細胞上的表達水平影響牙齦組織的炎癥反應程度［17］。本研究采用免疫組化方法觀察到TLR4陽性細胞在慢性牙周炎結締組織中的比例較正常對照組明顯增大，重度慢性牙周炎組TLR4表達的程度明顯高于輕度慢性牙周炎組，提示TLR4與牙周炎癥程度密切相關。

近年人們認識到肥大細胞具有獨特的免疫性能，除了在過敏和自身免疫性疾病中發揮重要作用外，還是重要的效應和調節性免疫細胞，能夠啟動快速而持續的免疫反應，對固有免疫和適應性免疫均有重要作用［18-19］。肥大細胞膜表面的TLRs受體，能夠識別廣泛的病原體產物以及損害相關分子模式［20］;而且，肥大細胞被激活后除了可新合成介質外，還預先儲備了大量的介質如組胺、蛋白酶、細胞因子(如 IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-16)和趨化因子等，一旦遇到相應的刺激，肥大細胞立即釋放介質并啟動固有免疫反應，引起炎癥反應或參與機體的防御反應［21-22］。細菌成分和炎癥細胞因子均可調節肥大細胞表面TLR4的表達，肥大細胞TLRs被激活后，不僅與其抗菌防御和炎癥反應的進展有關，也影響過敏反應的進程［23］。研究發現，TLRs被激活后可導致Th1型細胞因子的產生以及Th1細胞極化［24］;人和小鼠肥大細胞表面的TLR4受體可協同作用調節FcεRⅠ介導的肥大細胞信號通路，促進肥大細胞脫顆粒以及釋放Th2細胞因子［25］。本研究采用免疫熒光雙染色法證實了人慢性牙周炎牙齦組織的肥大細胞表達TLR4，我們的觀察發現重度牙周炎牙齦組織中，肥大細胞TLR4的表達率遠高于輕度牙周炎組，提示肥大細胞TLR4可能參與牙周組織的炎癥反應，在牙周炎的發病和疾病進程中起著重要的作用。但牙周炎組織內的肥大細胞如何通過TLR4識別牙周致病菌抗原而調節牙周病，以及肥大細胞如何通過TLR4信號轉導途徑調節牙周病發生和發展的作用機制尚需進一步研究。