紅花注射液對脂多糖誘導的兔彌散性血管內凝血的作用*

朱瑋瑋， 李夢佳， 馬蓮順， 劉 梅， 林 熙， 朱林燕， 肖 飛

(暨南大學醫學院藥理學系，廣東廣州510632)

彌散性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)是由于某些致病因子的刺激，凝血因子和血小板被激活，大量促凝物質進入血液中，導致血管內凝血酶增加，進而使微循環形成廣泛的微血栓，同時或繼發纖溶亢進，產生出血、休克、器官功能障礙和溶血性貧血等情況的一個病理過程［1］。DIC具有起病急驟、發展迅猛、預后兇險、死亡率高的特點。由于DIC病因及病理生理過程復雜，目前缺乏安全有效的治療方法。臨床上主要采取的措施是在積極治療原發病的基礎上采用抗凝、補充血小板及凝血因子、抑制纖溶、溶栓治療等，其中以肝素抗凝治療最為常用［2］。盡管肝素能在一定程度上抑制DIC的發展進程，但存在較嚴重的副作用，尤其容易引起或加重患者出血。因此，迫切需要尋找一種安全有效、毒副作用低的方法治療DIC。

紅花注射液是由單味藥物紅花精制而成，主要成分為紅花黃色素。紅花是菊科植物紅花的管狀花，具有活血通絡，祛瘀止痛的功效［3］。有研究表明，紅花黃色素具有抗凝血和抑制血栓形成的作用:紅花黃色素B可抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)誘導的體外大鼠最大血小板聚集率，延長大鼠離體血漿凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時間(activeated partial thromboplastin time，APTT)和凝血酶時間(thrombin time，TT)［4］。以上證據提示，紅花對凝血系統有很強的抑制作用。因此，紅花注射液可能對DIC有良好的拮抗作用。

高凝期是DIC的發展過程中至關重要的一個時期，此期凝血系統被激活，凝血酶產生增多，血液中凝血酶含量增高，血液表現為高凝狀態，微循環中形成大量微血栓，易造成血管栓塞以及器官功能異常［1］。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的 DIC模型主要是模擬DIC的高凝期，本研究擬通過注射LPS建立家兔DIC模型，觀察家兔凝血系統相關指標以及血漿丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、血尿素氮(blood urine nitrogen，BUN)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)的變化，從而證實紅花注射液對LPS誘導家兔DIC的拮抗作用。

材料和方法

1 動物

健康雄性新西蘭家兔60只，體重2．0～2．5 kg，由廣東省醫學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2008－0002。

2 試劑及儀器設備

紅花注射液購于山西亞寶藥業集團股份有限公司，每1 mL相當于紅花原生藥0．5 g。LPS購于Sigma;肝素購于山東博士倫福瑞達制藥有限公司;纖維蛋白(原)降解產物［fibrin(ogen)degradation products，FDP］和 TNF-αELISA試劑盒購于 BD Biosciences;蛋白C和抗凝血酶Ⅲ(antithrombin III，ATⅢ)活性檢測試劑盒購于上海太陽生物技術公司。Sysmex CA1500+CA6000全自動凝血分析儀(Kobe);Sysmex SE-9500全自動血細胞分析(Kobe);HITACHI 7170全自動血漿分析儀(Hitachi)。

3 主要方法

3．1 動物模型的建立 參照文獻［5-6］方法建立家兔DIC模型。從家兔耳緣靜脈按30 mg/kg注射3%戊巴比妥鈉麻醉，分離右側頸動脈、插管，以備取血。LPS溶于60 mL生理鹽水中，然后從家兔耳緣靜脈以100 μg·kg－1·h－1(10 mL/h)的速度滴注，連續 6 h給藥，建立家兔DIC模型。給藥后2 h和4 h腹腔注射戊巴比妥鈉，維持動物的持續麻醉狀態。

3．2 動物分組 將家兔隨機分6組，每組10只:(1)正常對照組;(2)DIC模型組;(3)低劑量紅花注射液治療組;(4)中劑量紅花注射液治療組;(5)高劑量紅花注射液治療組;(6)肝素對照組。

3．3 給藥方法 (1)正常對照組:從家兔雙側耳緣靜脈以10 mL/h的速度滴注生理鹽水(既不注射LPS，也不注射紅花注射液和肝素，連續6 h)。(2)DIC模型組:從家兔一側耳緣靜脈以100μg·kg－1·h－1(10 mL/h)的速度滴注LPS，同時從對側耳緣靜脈以10 mL/h的速度滴注生理鹽水，連續6 h。(3)紅花注射液治療組:將紅花注射液溶于60 mL生理鹽水，從家兔一側耳緣靜脈滴注LPS的同時，從對側耳緣靜脈以1 mL·kg－1·h－1(低劑量)、3 mL·kg－1·h－1(中劑量)和10 mL·kg－1·h－1(高劑量)的速度滴注紅花注射液(10 mL/h)，連續6 h給藥。(4)肝素對照組:將肝素溶于60 mL生理鹽水中，從家兔一側耳緣靜脈滴注LPS的同時，從對側耳緣靜脈以6×105IU·kg－1·h－1(10 mL/h)的速度滴注肝素，連續6 h給藥。

3．4 觀察指標和樣品的收集 在注射LPS前和注射2 h、6 h后分別從動脈取血1 mL，置于含有1/10體積的枸櫞酸鈉抗凝液的塑料管中，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，待測血漿－20℃保存。用Sysmex CA1500+CA6000全自動凝血分析儀檢測APTT、PT和纖維蛋白原含量;用Sysmex SE-9500全自動血細胞分析儀進行血小板(platelet，PLT)計數;用Hitachi 7170全自動血漿分析儀測定血漿ALT活性和BUN含量;用發色底物法測定血漿蛋白C及ATⅢ的活性;ELISA試劑盒檢測血漿FDP和TNF-α含量。

4 統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示。應用SPSS 13．0統計軟件對資料進行分析，組間均數比較采用單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 紅花注射液對LPS誘導的DIC兔死亡率的影響

給藥6小時后，DIC模型組家兔死亡數為5只，死亡率為50%;其余各組死亡數均為0只。與DIC組比較，各劑量紅花注射液組家兔死亡率均明顯下降(P ＜0．05)。

2 紅花注射液對LPS誘導的DIC兔凝血系統的影響

2．1 APTT和PT DIC模型組注射LPS 2 h和6 h后，APTT分別為(44.54±13.39)s和(98.62±24.51)s，與正常對照組［(19.69±1.97)s和(20.38±1.56)s］比較均明顯延長(P＜0.05)，見表1;DIC模型組 PT值分別為(11.73±1.69)s和(20.54±5.83)s，與正常對照組［(6.37 ±0.94)s和(6.05±0.56)s］比較均明顯延長(P ＜0.05)，見表1。用紅花注射液給藥2 h后，各劑量組APTT和中、高劑量組PT均明顯縮短(P＜0.05);給藥6 h后，各組APTT和PT都顯著縮短(P＜0.05)，見表1。肝素組在給藥6 h后APTT和PT亦明顯縮短(P＜0.05)，見表1。

2．2 血小板計數 DIC模型組注射LPS 2 h和6 h后，血小板計數分別為(283．08±34．76)×109/L和(186．36 ±27．51)×109/L，與正常對照組［(407．35±28．27)×109/L 和(416．83 ±21．56)×109/L］相比顯著下降(P＜0．05)，見表1。注射紅花注射液2 h后，中、高劑量組血小板計數明顯升高;給藥6 h后，各組血小板計數都顯著升高。肝素組在給藥2 h后血小板計數明顯升高，給藥6 h后顯著升高(P＜0．05)，見表1。

2．3 纖維蛋白原含量 DIC模型組注射LPS 6 h后纖維蛋白原含量(1．78±0．36)g/L，與正常對照組［(4．67 ±0．81)g/L］相比明顯降低(P ＜0．05)，見表1。注射紅花注射液6 h各劑量組纖維蛋白原含量顯著升高(P＜0．05)，見表1。肝素組在給藥6 h后纖維蛋白原含量明顯升高(P＜0．05)，見表1。

2．4 血漿FDP含量 DIC模型組注射LPS后FDP含量與正常對照組相比顯著升高(P＜0．05)，見表1。注射紅花注射液2 h后，中、高劑量組FDP含量明顯下降;6 h后各劑量組FDP含量均顯著下降(P＜0．05)，見表1。肝素組在給藥后FDP含量顯著下降(P ＜0．05)，見表1。

2．5 血漿蛋白C和ATⅢ活性 DIC模型組注射LPS 2 h和6 h后，血漿蛋白C水平分別為(67.97±17．68)% 和(41．09 ±16．19)%，與正常對照組［(94.63±5.46)%和(98.34±5.03)%］相比明顯降低(P＜0.05)，見表1;ATⅢ的活性水平分別為(79.30±14.87)%和(57.63±12.06)%，與正常對照組［(97.72±3.87)%和(99.67±3.14)%］相比明顯降低(P＜0.05)，見表1。注射紅花注射液6 h后，各組血漿蛋白C及ATⅢ活性水平均顯著升高(P＜0．05)，見表1。肝素組在給藥6 h后血漿蛋白C及ATⅢ活性明顯升高(P＜0．05)，見表1。

表1 紅花注射液對LPS誘導的DIC兔凝血系統的作用Table 1．Hemostatic parameters 2 h and 6 h after LPSinfusion into rabbits in different treatment groups(Mean±SD．n=10)

3 紅花注射液對LPS誘導的DIC兔血漿ALT及BUN的影響

DIC模型組注射LPS 2 h和6 h后血漿ALT及BUN均明顯升高(與正常對照組相比);注射紅花注射液2 h后，中、高劑量組血漿ALT活性與DIC模型組相比明顯下降(P＜0．05)，高劑量組血漿BUN含量與DIC模型組相比明顯下降(P＜0．05)，見圖1、2。注射紅花注射液6 h后，各組血漿ALT活性和BUN含量與DIC模型組相比均明顯下降(P＜0.05)，見圖1、2。

Figure 1．Effect of Safflower injection on the plasma level of ALT in LPS-induced DIC rabbits．Mean ± SD．n=10．*P ＜0．05 vs DIC group．圖1 紅花注射液對脂多糖誘導的DIC兔血漿丙氨酸氨基轉移酶活性的影響

Figure 2．Effect of Safflower injection on the level of BUNin LPS induced DIC rabbits．Mean ±SD．n=10．*P ＜0．05 vs DIC group．圖2 紅花注射液對脂多糖誘導的DIC兔血尿素氮的影響

4 紅花注射液對LPS誘導的兔DIC纖維蛋白微血栓的影響

DIC模型組注射LPS后，腎小球毛細血管袢可見廣泛性微血栓伴毛細血管腔中性粒細胞浸潤;低劑量紅花注射液組，腎小球毛細血管袢可見廣泛性微血栓伴毛細血管腔中性粒細胞浸潤;中劑量紅花注射液組未見明顯微血栓，毛細血管腔見少量中性粒細胞浸潤;高劑量紅花注射液組未見明顯微血栓，見圖3。

5 紅花注射液對LPS誘導的DIC兔血漿TNF-α含量的影響

DIC模型組注射LPS1 h、4 h、8 h和12 h后血漿TNF-α含量明顯升高(與正常對照組相比);注射紅花注射液1 h后，高劑量組血漿TNF-α含量與DIC模型組相比明顯下降(P＜0．05);注射紅花注射液4 h、8 h和12 h后，各組血漿TNF-α含量與DIC模型組相比均明顯下降(P＜0．05)，見圖4。

討 論

DIC是一種由不同原因引起的、以全身性血管內凝血系統激活為特征的獲得性綜合征。這種改變可來自并引起微血管系統的損害，嚴重時可導致器官功能衰竭［7］。在眾多引發DIC的原因中，感染性疾病是最為常見的一種。感染性DIC主要表現在凝血系統激活，大量凝血因子消耗，生成過量凝血酶，繼而在微循環內形成血栓。LPS即內毒素，是革蘭陰性菌細胞壁中的主要成分，其分子結構由O特異性多糖、非特異性核心多糖和脂質A三部分組成。高濃度的LPS可激活補體替代途徑，引起發熱、低血壓，以及活化凝血系統，最后導致DIC［8］。本實驗通過靜脈持續滴注LPS誘導家兔DIC的發生，實驗結果顯示APTT和PT呈進行性延長，血小板計數和纖維蛋白原含量明顯降低;ALT和BUN明顯升高;蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性顯著降低;血清TNF-α含量顯著升高。這與Hermida等［9］的實驗結果一致，表明已成功建立兔DIC模型。

反映凝血系統功能的重要指標主要有APTT、PT、纖維蛋白原含量、血小板計數、蛋白C含量、ATⅢ等。它們在DIC的過程中都起著非常重要的作用。APTT能反映血漿凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ水平，是評價內源凝血系統較為敏感和最常用的指標。PT是用于檢測外源性凝血途徑、維生素K依賴性凝血因子缺陷以及存在相關因子抑制物的過篩實驗。它反映凝血因子Ⅰ、Ⅱ、V、Ⅶ和X的含量或循環抗凝物質的存在［10］。血小板是止血及凝血中所需的一種極其重要的物質，血小板活化后，不僅依賴本身的黏附與聚集功能而形成白色血栓，更通過其促凝作用加強血凝，促使纖維蛋白原轉為纖維蛋白，加重、加速DIC的發生發展。纖維蛋白原即凝血因子Ⅰ，是血漿中含量最高的凝血因子［11］。FDP對凝血酶具有明顯的抑制作用，能與纖維蛋白原以及纖維蛋白單體形成可溶性復合物，從而抑制纖維蛋白的形成［11］。蛋白C是人體內一種重要的抗凝因子，其以無活性的酶原形式存在于血漿中，可在凝血酶作用下轉變

為活化蛋白C(activeated protein C，APC)，發揮以下作用:(1)滅活凝血因子Ⅴa和Ⅷa;(2)抑制纖溶酶原激活劑抑制物(PAI)組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)，從而激活纖溶系統;(3)抑制凝血因子Ⅹa、Ⅴa與血小板膜磷脂的結合;(4)加強ATⅢ-凝血酶復合物的結合。ATⅢ是一種多功能的絲氨酸蛋白酶抑制劑，對以絲氨酸為活性中心的被激活的凝血因子(Ⅸa、Ⅹa、Ⅺa、Ⅻa、Ⅶa)、凝血酶以及蛋白酶(纖溶酶、激肽釋放酶、胰蛋白酶)都有抑制作用，它對因子Ⅹa的抑制作用大于凝血酶［12］。與DIC模型組相比，用紅花注射液給藥后各組APTT和PT都明顯縮短、FDP含量明顯降低、纖維蛋白原含量和血小板計數都明顯升高、蛋白C和ATⅢ進行性升高。由此表明紅花注射液可以減輕DIC所致的凝血反應、減少凝血物質的消耗、增強抗凝物質的作用，并且通過同時抑制內源性、外源性凝血通路從而發揮抗凝血作用。

Figure 3．Effect of Safflower injection on the formation of fibrin microthrombi in LPS-induced DIC rabbits(fibrin staining，×400)．圖3 紅花注射液對脂多糖誘導的DIC兔纖維蛋白微血栓的影響

BUN和ALT是評價肝腎功能的重要實驗室指標。當BUN升高時，提示腎實質受到損害;當ALT升高時，提示肝細胞受到損害。紅花注射液使LPS所誘導的DIC兔的ALT和BUN顯著下降，提示紅花注射液可以在LPS誘導的兔DIC發生時保護肝、腎等重要器官的功能。其作用機制有待進一步的研究。

炎癥介質的釋放是DIC發病機制中的重要組成部分，各種促炎介質通過活化內皮細胞、促進凝血及補體活化等作用使機體產生全身炎癥反應，從而導致DIC的發生［13］。有研究表明，TNF-α可明顯增加組織因子的表達和活性，而TF是外源性凝血系統的啟動子，TF表達增加可引起凝血級聯反應，誘發血栓形成及DIC［13-14］。與DIC模型組相比，用紅花注射液所治療3組的血漿TNF-α含量都明顯下降。從而提示紅花注射液可以通過降低促炎因子的水平來起到對LPS所致的兔DIC的拮抗作用。

綜合上述，在LPS所致的兔DIC模型中，紅花注射液可以明顯降低DIC兔的死亡率，顯著縮短APTT和PT，明顯升高血小板計數和纖維蛋白原含量，顯著增強蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性，有效降低FDP、ALT、BUN和TNF-α水平。這可能是與紅花注射液可以減少炎癥介質的表達、減少凝血物質消耗、促進抗凝系統激活以及抑制凝血系統的發展有關。同時，紅花注射液可以減少肝腎等重要臟器在LPS誘導的DIC發生時的損傷。由此表明紅花注射液對LPS所致的DIC有明顯的拮抗作用，為今后DIC的預防與早期治療提供了新的途徑。