NF-κB在膿毒癥血漿誘導的內皮細胞損傷和凋亡中的作用*

梁英健， 李 鑫， 張曉娟， 劉志永， 馬曉春

(中國醫科大學附屬第一醫院重癥醫學科，遼寧沈陽110001)

膿毒癥的發生發展打破了機體細胞增生和死亡之間的精確平衡，細胞凋亡的變化是病原體和宿主之間相互作用的結果。近年來研究顯示細胞凋亡變化是膿毒癥重要的病理變化之一［1］。膿毒癥時免疫細胞和組織細胞的凋亡發生異常與病程和預后密切相關，同時糾正凋亡異常的治療措施逐漸發展并且在動物實驗中也取得了很好的療效［2］。內皮系統功能失調是膿毒癥器官衰竭和死亡的一個重要特征，從細胞水平上說這種內皮功能喪失主要是由于內皮細胞凋亡的增加［1］。核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)作為一類具有多向轉錄調節作用的核蛋白因子，在細胞凋亡中同樣具有重要的作用。本文就NF-κB在膿毒癥引起的內皮損傷和細胞凋亡中的作用做進一步的探討。

材料和方法

1 膿毒癥患者和健康對照者血漿的獲得

選取2008年6月～2008年11月在中國醫科大學附屬第一醫院重癥醫學科住院治療的腹腔感染患者22名，其中男性13名，女性9名。年齡36～90歲，平均(65．7±13．9)歲。對照組為8 名健康者，男性5名，女性3名，年齡(60．2±11．3)歲。所有患者均符合美國胸科醫師學會和危重病學會提出的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)診斷標準的全部或至少2項。每名患者在發生膿毒癥24 h內采血10 mL，對照組每名采血5 mL。枸櫞酸鈉抗凝，4℃ 1 000 r/min 15 min，獲得血漿。分裝后－70℃保存。每個病例都填寫了知情同意書。

2 方法

2．1 內皮細胞的培養 人臍靜脈內皮細胞系(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購自復旦大學醫學部。細胞復蘇后于20%胎牛血清的DMEM(Gibco)培養液中傳代，所有實驗細胞在體外擴增均不超過15代。

2．2 膿毒癥血漿刺激HUVECs上清液的制備 HUVECs經胰蛋白酶消化后，調整細胞數為5×108/L，種植于24孔板中，在培養箱中培養36～48 h，再換用無酚紅無血清的DMEM培養液培養24 h，使細胞同步于G0期。陰性對照組分別加入10%、20%和30%正常人血漿;實驗組分別加入10%、20%和30%膿毒癥患者血漿;拮抗劑組加入NF-κB拮抗劑PDTC(Sigma)100μmol/L，1 h后再加入20%膿毒癥患者血漿，收集上清液，1000 r/min，離心10 min)，分裝，－70℃凍存。

2．3 ELISA應用ELISA方法檢測von Willebrand因子(von Willebrand factor，vWF)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)。人 vWF 的 ELISA試劑盒購自ADL，人TNF-αELISA試劑盒購自晶美生物工程有限公司。具體方法嚴格按說明書進行。每組樣品做3孔。

2．4 免疫熒光 將制成的細胞懸液種植于由0．2%明膠包被的玻片上，培養24 h;換用無血清的DMEM培養液培養24 h，使細胞同步于G0期。實驗組加入20%膿毒癥患者血漿，拮抗劑組在加入血漿前1 h加入PDTC 100μmol/L;經過4%多聚甲醛固定，0．2%Triton X-100打孔，3%BSA封閉后，加入30μL I抗NF-κB抗體，4℃過夜;PBS沖洗干凈，加入30μL TRITC標記的II抗(北京中杉生物試劑有限公司)，37℃孵育1 h;在熒光顯微鏡下拍照。

2．5 MTT比色法 HUVECs經胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，以5×103cells/well的細胞數接種于96孔板中，在培養箱中培養36～48 h，再換用無酚紅無血清的DMEM培養液培養24 h，使細胞同步于G0期。實驗組加入10%膿毒癥血漿;拮抗劑組加入二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)(25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L 和 200 μmol/L)作用1 h后，再加入10%膿毒癥血漿作用18 h;陰性對照組為正常的HUVECs。每個實驗組設3個平行孔。每孔加入20μL無菌MTT(5 g/L)孵育4 h，再加入150μL DMSO，于微量振蕩器充分振蕩10 min，用酶標儀于490 nm波長條件下測定吸光度值。

2．6 流式細胞術 培養瓶中細胞基本融合后，加入無血清DMEM作用24 h;實驗組加入10%膿毒癥血漿;拮抗劑組加入PDTC 100μmol/L 1 h后，再加入10%膿毒癥血漿，作用18 h;制成細胞懸液并收集于離心管中，2 000 r/min離心5 min，棄上清;PBS洗滌細胞2次后再次2 000 r/min離心5 min，棄上清;依次加入500μL binding buffer、5μL AnnexinV-FITC 和5μL碘化丙啶(propidium iodide，PI);混勻后過濾;室溫、避光、反應5～15 min，1 h內在流式細胞儀檢測。Annexin V+/PI－為凋亡細胞。

3 統計學處理

數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示。組間差異采用One-way ANOVA和SNK-q檢驗分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 膿毒癥患者和正常人血中TNF-α和vWF的變化

膿毒癥患者血中TNF-α和vWF明顯高于正常人(P＜0．01)，表明膿毒癥患者存在內皮細胞損傷，見表1。

表1 vWF和TNF-α在膿毒癥患者和正常人中的檢測Table 1．The concentrations of plasma TNF-α and vWF in septicpatients and healthy controls(Mean±SEM．n=3)

2 膿毒癥患者血漿引起的內皮細胞損傷呈時間－劑量依賴關系

分別用10%、20%和30%膿毒癥患者血漿刺激HUVECs，10%、20%和30%正常人血漿做陰性對照，膿毒癥患者血漿刺激HUVECs釋放vWF在120 min達到高峰，隨之下降。10%、20%和30%膿毒癥患者血漿刺激HUVECs均可引起vWF的升高，30%膿毒癥患者血漿引起內皮細胞損傷最強。在10～120 min內，vWF和TF的升高與膿毒癥血漿呈時間－劑量依賴關系，見圖1。

Figure 1．Increased production of vWF from HUVECs treated with septic plasma(SP)．NP:normal plasma．Mean±SEM．n=3．*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01 vs NP at the same concentration．圖1 膿毒癥患者血漿引起vWF升高

3 膿毒癥患者血漿刺激HUVECs后NF-κB活化

用20%膿毒癥患者血漿刺激HUVECS，應用免疫熒光的方法觀察NF-κB活化。在10 min時即可看見NF-κB的活化(由胞漿轉移到胞核)，30 min達到高峰，見圖2。

Figure 2．Septic plasma(SP)activated NF-κB in HUVECs．A:control;B:20%SP for 10 min;C:20%SP for 30 min．Mean ±SD．n=3．＊＊P ＜0．01 vs A．圖2 膿毒癥患者血漿刺激HUVECs后NF-κB活化

4 NF-κB參與膿毒癥患者血漿引起的內皮細胞損傷

在膿毒癥患者血漿刺激HUVECs之前加入NF-κB拮抗劑PDTC，PDTC的濃度為100μmol/L時，細胞活力受到明顯影響，見圖3。在加入20%膿毒癥患者血漿刺激HUVECs之前1 h加入NF-κB拮抗劑PDTC 100μmol/L，可以看到PDTC抑制了HUVECs中vWF的升高，表明NF-κB參與膿毒癥的內皮損傷，見圖4。

Figure 3．The viability of HUVECs treated with septic plasma(SP)and pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)determined by MTT．Mean±SEM．n=3．*P ＜0．05 vs control;#P ＜0．05，##P ＜0．01 vs 20%SP．圖3 MTT比色法檢測PDTC濃度

Figure 4．Effects of NF-κB inhibitor PDTCon of vWFproduction in HUVECs treated with septic plasma(SP)．Mean±SEM．n=3．*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01 vs20%SP．圖4 加入NF-κB拮抗劑后vWF的變化

5 NF-κB參與了膿毒癥引起的內皮細胞凋亡

加入NF-κB拮抗劑PDTC 100μmol/L 1 h后再分別加入10%膿毒癥患者血漿和10%正常人血漿作用HUVECs 18 h，對照組HUVECs凋亡率為(4．39±0．12)%;10%正常人血漿作用18 h HUVECs凋亡率為(4．85±0．13)%;10%膿毒癥患者血漿作用18 h ，HUVECs凋亡率增加至(10．79 ±0．14)%;加入NF-κB 拮抗劑 PDTC18 h，HUVECs凋亡率增加至(16.03 ±0．12)%，見圖5。

Figure 5．Effects of differents factors on apoptosis of HUVECs at 18 h．A:control;B:10%normal plasma for 18 h;C:10%septic plasma for 18 h;D:100μmol/L PDTC for 1 h and 10%septic plasma for 18 h．圖5 不同因素作用18 h對HUVECs凋亡的影響

討 論

膿毒癥的早期即有內皮細胞的活化和損傷，在膿毒癥病人引發多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的過程中，內皮細胞的活化－損傷起了重要的作用［3］。vWF存在于血管內皮細胞的 Weibel-Palade小體、血漿和血小板α顆粒中，當血管內皮細胞受損時，vWF等內容物釋放入血增多，因此vWF是反映內皮細胞受損的重要標記物，其水平高低可反映血管內皮受損嚴重程度［4］。我們檢測了膿毒癥患者血漿以及用膿毒癥患者血漿刺激HUVECs后vWF的濃度，發現vWF均明顯升高，表明膿毒癥時存在內皮細胞的損傷。

為了明確膿毒癥時影響內皮損傷的炎癥介質，我們檢測了TNF-α。TNF-α處于眾多炎癥因子中的核心地位，能夠刺激其它各種促炎癥細胞因子的生成［5］。NF-κB、AP-1、ATF-2 等都是能與 TNF-α 基因啟動子和增強子結合而促進轉錄的轉錄因子［6］。它們的活化都依賴于p38的活化。同時TNF-α的活化又進一步激活各種信號通路和轉錄因子，激活炎癥細胞，兩者互為因果，進而形成炎癥級聯反應，造成炎癥介質泛濫。膿毒癥血漿富含細胞因子，化學因子和其它炎癥介質［7］，TNF-α是其中主要物質之一。本實驗中22名膿毒癥病人的血漿中TNF-α明顯高于健康對照者［(155．68 ±89．74)ng/L vs(5．00 ±0.47)ng/L，P ＜0．01］，進一步驗證了 TNF-α 是影響內皮細胞損傷的主要炎癥介質。

為進一步明確膿毒癥發生內皮細胞損傷和凋亡的分子機制，我們檢測了NF-κB途徑。NF-κB與細胞凋亡的關系密切，其參與多種凋亡相關基因的轉錄調控［8］。NF-κB 的活化核轉錄是通過 IKK/NF-κB途徑進行的［9-10］。靜息狀態下，細胞質中的p50/p65與IKB結合成三聚體，使p50/p65不能核移位。當受到菌血癥和內毒素等刺激后，IκB發生磷酸化和降解，使NF-κB成為具有活性的形式并迅速發生核移位，在細胞核中尋找特定靶基因啟動子區的κB位點并與之結合，指導下游基因表達調控［9］。本實驗中用膿毒癥血漿刺激HUVECs，NF-κB活化，從胞漿移位入胞核，應用NF-κB拮抗劑PDTC阻斷時，vWF降低，表明NF-κB參與了膿毒癥的內皮細胞損傷。應用流式細胞儀檢測細胞凋亡，加入NF-κB拮抗劑PDTC后，HUVECs凋亡增加，表明NF-κB在膿毒癥血漿引起的內皮細胞凋亡中起抑制凋亡的作用。

在膿毒癥中存在內皮細胞損傷，內皮細胞凋亡增加，NF-κB在膿毒癥引起的內皮細胞損傷和凋亡中起重要作用。