類人慢性粒細胞性白血病小鼠模型的建立*

潘 勤， 金 紅， 李 婧， 姜支農， 姚云斌， 胡金飛， 李 達， 金 梅， 潘宏銘

(浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院腫瘤內科，浙江杭州310016)

慢性粒細胞性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種起源于多能造血干細胞的惡性克隆增殖性疾病，是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一。其特征性的染色體易位t(9;22)(q34;q11)使位于9q34的ABL原癌基因易位至22q11的BCR基因的3'端，形成BCR/ABL融合基因，由此產生的衍生第22號染色體又稱為費城染色體(Philadelphia chromosome，Ph)。95% 的CML患者骨髓中可檢測到費城染色體和(或)BCR/ABL融合基因［1］。以往對于CML的研究結果，多來自患者外周血、骨髓細胞以及腫瘤細胞系水平的研究。在此基礎上，我們對CML的認識取得了很大進展。近來動物模型在腫瘤病因的揭示、發病機制的探索以及治療措施的評估中顯示出了不可替代的重要作用［1］。在本研究中，我們通過改進逆轉錄病毒包裝技術，用p210 BCR/ABL逆轉錄病毒載體感染小鼠骨髓細胞成功建立了CML小鼠移植模型，為進一步研究CML的發病機制及疾病進展，篩選新的治療藥物，研究其它致癌基因的功能提供了平臺。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 6～8周齡雌性和雄性SPF級BALB/c小鼠，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。飼養于浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院實驗動物中心SPF級實驗環境中。

1.2 質粒構建 逆轉錄病毒載體MigR1(MSCVIRES-GFP，逆轉錄病毒空載體)由Warren S.Pear博士惠贈;將Nco I-Mlu I-Not I-Nco I接頭序列插入MigR1的Nco I位點，然后將BCR/ABL cDNA克隆入Mlu I和Not I位點之間，構建BCR/ABL載體(MSCVBCR-ABL-IRES-GFP，含BCR/ABL的逆轉錄病毒載體)。MigR1及BCR/ABL載體的簡圖見圖1。

1.3 細胞 BOSC23包裝細胞和NIH 3T3細胞均用DMEM(Gibco-BRL)培養液培養，培養液中包括:10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和2 mmol/L L-谷氨酰胺。在37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.4 試劑 BCR抗體，β-actin抗體，抗兔IgG-HRP均購自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1 逆轉錄病毒載體磷酸鈣法轉染包裝細胞及技術改進 包裝前1 d，按一定密度將BOSC23細胞接種于6 cm培養皿，于37℃、5%CO2培養箱中培養過夜。包裝當天，向6 cm培養皿中加新鮮培養液3 mL。用磷酸鈣法轉染包裝細胞(Calcium Phosphate Cell Transfection Kit;Promega)。按廠家推薦的方法配制磷酸鈣轉染體系混合液。取1 mL混合液逐滴加入到6 cm培養皿中，混勻。置37℃、5%CO2培養箱中孵育。10 h后，換3 mL新鮮培養液繼續培養。于轉染后48 h收集病毒上清。改進逆轉錄病毒包裝技術，在相同實驗條件下包裝MigR1病毒顆粒，改變以下條件之一，進行病毒滴度的測定。

2.2 實驗分組 A組:高質量質粒(經電泳檢測僅有超螺旋狀態的質粒);B組:一般質量質粒(經電泳檢測超螺旋、開環和/或線性狀態共存的質粒);C組:BOSC23細胞狀態佳 (細胞伸展、貼壁、透光性好);D組:BOSC23細胞狀態一般(細胞伸展、貼壁、透光性均一般);E組:包裝前1 d，按2.5×108/L將BOSC23細胞接種于6 cm培養皿，包裝當天達50%～60%細胞融合;F組:包裝前1 d，按5.0×108/L將BOSC23細胞接種于6 cm培養皿，包裝當天達70%～80%細胞融合;G組:包裝前1 d，按7.5×108/L將BOSC23細胞接種于6 cm培養皿，包裝當天達90%～100%細胞融合。

2.3 病毒滴度測定 感染前1 d，按2.5×107/L將NIH 3T3細胞接種于12孔板中，37℃、5%CO2培養箱中培養過夜。感染當天用DMEM培養液按1∶1比例稀釋上述制備的病毒上清，終體積為2 mL，加入聚凝胺(polybrene，hexadimethrine bromide;Sigma)至終濃度4 mg/L。于37℃、5%CO2培養箱中培養，4 h后換新鮮培養液，感染后48 h收獲細胞，流式細胞術檢測GFP陽性率。

2.4 流式細胞術檢測GFP陽性率及Western blotting法檢測目的蛋白表達 選擇病毒滴度最高(即GFP陽性率最高)的條件進行實驗。包裝MigR1及BCR/ABL病毒顆粒，感染NIH 3T3細胞，流式細胞術檢測GFP陽性率，同時行Western blotting檢測BCR/ABL表達。BCR/ABL組移植小鼠發病時檢測其脾組織中BCR/ABL融合蛋白的表達，同時檢測MigR1組移植小鼠脾組織。收集細胞，加入預冷的RIPA裂解液(碧云天生物技術研究所)100μL裂解細胞，上清經Bradford法蛋白定量后，取30μg蛋白以8% ～12%SDS-PAGE電泳，常規轉膜。室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的BCR或β-actin抗體，4℃過夜，再與1∶2 000稀釋的抗兔IgG-HRP室溫反應30 min，充分洗滌后經ECL試劑盒化學發光顯色(Amersham Pharmacia Biotech)，用 LAS 4000 mini化學發光成像系統(Fujifilm)。

2.5 逆轉錄病毒上清制備及小鼠骨髓細胞移植 BOSC23細胞分別包裝MigR1和p210 BCR/ABL逆轉錄病毒顆粒，感染經5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)處理后的供體小鼠骨髓細胞，感染后的小鼠骨髓細胞再移植入經致死劑量X射線照射的受體小鼠體內，流程圖見圖2。

Figure 2.Flow chart of MigR1 or BCR/ABL retroviral infection and bone marrow transplantation in mice.圖2 MigR1或BCR/ABL逆轉錄病毒感染小鼠骨髓細胞及骨髓移植流程圖

2.6 小鼠骨髓移植后觀察指標 (1)觀察移植后小鼠狀態，包括活動性、反應性以及脫毛等表現;(2)小鼠骨髓移植后2周，流式細胞術檢測小鼠外周血GFP陽性率;(3)移植小鼠發病垂死時，進行小鼠外周血細胞計數和分類(瑞氏-姬姆薩染色)，同時進行對照小鼠外周血細胞計數和分類;(4)骨髓細胞分析:分離骨髓細胞，經無菌的70μm細胞濾網(BD Biosciences)過濾，制備單個細胞懸液，經TXT3細胞涂片離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)甩片，瑞氏-姬姆薩法色，觀察細胞形態并進行分類;(5)肝臟和脾臟病理分析:觀察標本大小，部分標本用于病理檢測。

3 統計學處理

采用GraphPad Prism 5統計軟件分析，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。Kaplan-Meier法進行生存分析。

結 果

1 逆轉錄病毒包裝技術的改進

應用高質量的質粒、BOSC23細胞狀態佳、轉染當天70%～80%的細胞密度等條件，包裝獲得的病毒上清感染NIH 3T3細胞后的GFP陽性率均高于相應的對照，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖3。

2 MigR1及BCR/ABL病毒上清感染NIH 3T3細胞后，GFP陽性率測定及目的蛋白的表達

MigR1及BCR/ABL病毒上清稀釋2倍后分別感染NIH 3T3細胞，48 h收集NIH 3T3細胞，流式細胞術檢測GFP陽性率，MigR1組為 (93.99±0.83)%，BCR/ABL組為(46.95±3.13)%，有顯著差異 (P＜0.01)，見圖4A。這提示質粒的大小是影響逆轉錄病毒包裝效率的主要因素之一。同時裂解NIH 3T3細胞總蛋白，采用Western blotting檢測目的蛋白表達，結果證實經BCR/ABL病毒上清感染的NIH3T3細胞中可檢測到 BCR/ABL的表達，而經空載體MigR1病毒上清感染的NIH 3T3細胞中則不表達BCR/ABL，見圖4B。

Figure 3.Comparison of GFP positive rates in NIH 3T3 cells infected with MigR1 retroviral supernatant under different conditions.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs regular;#P＜0.05 vs 2.5 or 7.5.圖3 不同實驗條件下MigR1逆轉錄病毒上清感染NIH 3T3細胞后GFP表達的陽性率比較

Figure 4.The expression levels of GFP(A)and BCR/ABL(B)in NIH 3T3 cells after infection with MigR1 or BCR/ABL retroviral construct.Mean ± SD.n=3.＊＊ P ＜0.01 vs MigR1.圖4 MigR1和BCR/ABL逆轉錄病毒上清分別感染NIH3T3細胞后，GFP及BCR/ABL蛋白的表達

3 MigR1組和BCR/ABL組移植小鼠外周血GFP陽性率及脾組織BCR/ABL的表達

小鼠分為2組，MigR1組為對照組，共9只小鼠;BCR/ABL組為實驗組，共15只小鼠。移植2周后取小鼠外周血，流式細胞術檢測GFP陽性細胞比例，MigR1組及BCR/ABL組小鼠外周血GFP陽性率分別為(63.96±9.82)%和(76.80±11.40)%，兩組之間無顯著差異 (P＞0.05)，見圖5A。BCR/ABL組小鼠發病時取小鼠脾組織做Western blotting，檢測目的蛋白表達。在BCR/ABL組小鼠脾組織中可檢測到BCR/ABL的表達，而MigR1組小鼠脾組織中不表達BCR/ABL，見圖5B，提示MigR1組及BCR/ABL組均移植成功。

Figure 5.The expression levels of GFP in peripheral blood(A)and BCR/ABL in spleen tissues(B)of MigR1 or BCR/ABL bone marrow transplantaion mice.Mean±SD.圖5 MigR1組和BCR/ABL組移植小鼠外周血GFP陽性細胞的比例及脾組織BCR/ABL的表達

4 移植后發病小鼠外周血計數

BCR/ABL組小鼠發病后表現為活動差，脫毛，反應差，均于19～25 d死亡，取所有發病小鼠外周血進行計數，同時檢測MigR1組小鼠外周血。與MigR1組相比，BCR/ABL組小鼠白細胞顯著升高，差異有統計學意義 (P＜0.01)，見圖6。

Figure 6.The white blood cell count in MigR1 mice and BCR/ABL diseased mice.Mean ± SD.＊＊ P ＜ 0.01 vs MigR1.圖6 MigR1組及BCR/ABL組發病小鼠外周血白細胞計數

5 外周血及骨髓細胞形態學檢查

BCR/ABL組小鼠發病垂死時，頸椎脫臼法處死小鼠。取外周血涂片，并分離骨髓細胞，細胞涂片離心機甩片。外周血和骨髓涂片進行瑞氏-姬姆薩染色，顯微鏡下觀察。結果發現，MigR1組小鼠外周血及骨髓各系細胞形態、比例正常。BCR/ABL組小鼠外周血涂片可見粒細胞增生活躍，比例明顯增高，以成熟粒細胞為主，并出現少量幼稚細胞;骨髓片見粒系增生極度活躍，以中晚幼粒及成熟粒細胞增生為主，可見少量原始粒細胞，局部區域可見嗜酸、嗜堿粒細胞，紅系及其它系增生均受抑，見圖7。

Figure 7.Peripheral blood and bone marrow smears of MigR1 mice and BCR/ABL diseased mice(Wright-Giemsa staining，×1 000).圖7 MigR1組小鼠及BCR/ABL組發病小鼠外周血及骨髓片

6 肝脾病理學檢查

取MigR1組小鼠及BCR/ABL組發病小鼠的肝臟和脾臟做病理學檢查，結果發現，和MigR1組小鼠相比，發病小鼠肝臟、脾臟明顯腫大。MigR1組小鼠肝組織正常結構存在，脾臟結構完整，紅白髓質相間，均未見腫瘤性細胞浸潤。BCR/ABL組發病小鼠的肝組織正常結構破壞，可見不同發育階段的腫瘤性粒細胞浸潤，呈巢團狀密集分布;脾臟正常結構破壞，為大量腫瘤性粒細胞所浸潤，見圖8。

7 2組小鼠生存狀況比較

小鼠移植后觀察180 d，MigR1組小鼠均存活，BCR/ABL組小鼠均于移植后19～25 d發病死亡，用Kaplan-Meier法比較2組小鼠生存率，見圖9，2組之間有顯著差異(P＜0.01)。

Figure 8.Histological changes of the liver and spleen of MigR1 mice and BCR/ABL diseased mice(HE staining，×400).圖8 MigR1組小鼠及BCR/ABL組發病小鼠肝、脾組織學變化

Figure 9.Survival rates of MigR1 mice and BCR/ABL diseased mice compared by Kaplan-Meier method.圖9 Kaplan-Meier法比較MigR1組和BCR/ABL組小鼠的生存率

討 論

CML是一種發生于造血干細胞的血液系統惡性克隆性增生性疾病。95% 的患者骨髓中可檢測到Ph染色體和 (或)BCR/ABL融合基因［1］。研究顯示，p210 BCR/ABL具有增強酪氨酸激酶的活性，改變了細胞多種蛋白質酪氨酸磷酸化水平和細胞微絲機動蛋白的功能，從而擾亂了細胞內正常的信號轉導通路，使細胞失去了對周圍環境的正常反應，并抑制了凋亡的發生，是CML形成的主要分子基礎［2］。

動物模型是進行CML發病機制研究的重要工具。目前，制備CML動物模型的方法主要有3種，即用CML細胞種植重癥聯合免疫缺陷 (severe combined immunodeficency，SCID)或非肥胖型糖尿病/重癥聯合免疫缺陷(nonobese diabetic/sever combined immunodeficiency，NOD/SCID)小鼠的模型、BCR/ABL轉基因動物模型和用表達p210 BCR/ABL逆轉錄病毒感染小鼠骨髓細胞的移植模型(p210 BCR/ABL移植模型)［3-5］。國外多個實驗室應用 p210 BCR/ABL已構建了CML小鼠移植模型［3-5］，而國內尚未見報道。我們在借鑒國外實驗方法的基礎上，進一步改進了逆轉錄病毒的包裝技術。在實驗過程中，我們發現質粒的大小、質粒抽提的質量、包裝細胞的狀態、轉染當天細胞的密度等條件均可影響病毒包裝的效率。通過優化這些條件，我們提高了包裝病毒的滴度，應用p210 BCR/ABL逆轉錄病毒感染小鼠骨髓細胞后進行移植，快速地誘導了CML的發生，其表型類似人CML的慢性期。Western blotting檢測發病小鼠脾組織證實有BCR/ABL表達。考慮到外源性導入的BCR/ABL而非小鼠自身染色體異常形成的融合基因誘導了CML的表型，我們未對小鼠染色體核型進行分析。

與另外2種制備CML動物模型的方法相比，p210 BCR/ABL移植模型潛伏期短，移植后至發病死亡僅19～25 d，外顯率高，重復性好，均為100%。而CML細胞種植免疫缺陷鼠模型中，由于小鼠的造血生長因子、黏附分子和細胞外基質與人類有較大差異，人造血細胞和白血病細胞難以在小鼠體內定植，應用該方法制備的免疫缺陷小鼠-人CML模型存在一定的局限性。轉人造血生長因子基因的免疫缺陷鼠可望進一步用于制備較為理想的人CML小鼠模型［6-7］。國內也有人用EL9611紅白血病細胞進行BALB/c鼠尾靜脈輸注建立紅白血病動物模型的報道［8］。在BCR/ABL轉基因動物模型的研究中發現，BCR/ABL融合蛋白的表達對小鼠的胚胎有致死性。雖然通過構建條件性轉基因小鼠模型，或選擇合適的啟動子可克服這一難題，但BCR/ABL轉基因動物模型所需的技術難度較大，周期較長，工作強度較大、轉基因整合率低，較難普及應用［9-12］。因此，p210 BCR/ABL移植模型正被用于BCR/ABL致病的信號通路研究及新的治療方法的評估。

自伊馬替尼、尼洛替尼和達沙替尼等靶向藥物相繼問世以來，針對CML患者的治療取得了巨大的進展，開創了惡性腫瘤靶向治療的成功范例。然而，仍有部分患者對靶向藥物不敏感，而且部分CML患者經靶向藥物治療后，最終還是產生耐藥而發生急性變，對這部分患者的治療仍面臨困難［9，13］。國內外現有的研究顯示，BCR/ABL可激活多個信號通路，包括 Ras、Raf、Ras、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine-specific protein kinase，Akt)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、信號轉導子及轉錄激活子家族(signal transducer and activator of transcription，STATs)、c-Myc、Bcl-2、Bcl-xL等。BCR/ABL還可干擾CML細胞的黏附和(或)遷移能力，誘導細胞因子的表達，如白細胞介素3(interleukin 3，IL-3)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GMCSF)和粒細胞集落刺激因子(granulocyte colonystimulating factor，G-CSF)［1，4］。雖然進行了大量的研究，然而BCR/ABL如何激活這些信號通路，以及信號通路的改變與CML表型間的相關性等尚不清楚，還未真正解決有效阻止CML急變及急變后的治療問題。因此，有必要在模型動物水平進行深入研究，以進一步闡明CML的分子致病機制，發現BCR/ABL激活的信號通路中起重要作用的結構域以及BCR/ABL表達細胞所處微環境在腫瘤形成中的作用，尋找CML治療的潛在靶點。

但是，這一模型還存在不足，如3周左右即發生致死性髓系增殖性疾病，無法觀察到急變的過程。考慮到其發生致死性疾病可能是由于BCR/ABL的過表達，可通過對載體進行修飾或其它方法，降低BCR/ABL的表達，從而延長小鼠生存期，以改良此小鼠模型，進而觀察BCR/ABL本身及與其它相關基因共同作用對白血病的影響。

(致謝:本實驗均在我院動物實驗室、生物醫學研究中心、浙江省生物治療重點實驗室及浙江大學腫瘤研究所完成，并得到了我院腫瘤中心各位醫師及技師的幫助，表示誠摯的感謝。)