左、右歸丸及其拆方對骨髓間充質干細胞成骨分化的影響*

宋 囡， 何文智， 王智民， 任艷玲△

(遼寧中醫藥大學1基礎醫學院，2藥學院，3第一臨床學院，遼寧沈陽110032)

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種多潛能細胞，可分化為多種細胞，通過誘導其分化為成骨細胞后，促進骨形成，是骨組織工程中的重要部分［1］。傳統中醫學認為，腎藏精，精生髓，髓養骨，而BMSCs主要來自于骨髓中，與中醫學“腎主骨”理論有相似之處［2-3］。左、右歸丸為中醫補腎經典方劑，分別具有滋補腎陰和溫補腎陽之功，雖然既往有左、右歸丸均能促進BMSCs成骨分化的研究［4-5］，但未見到兩方對BMSCs成骨誘導的比較研究。本文旨在通過觀察左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs成骨分化的影響，探討以“滋補腎陰”和“溫補腎陽”立法的方藥對BMSCs成骨分化的影響機制。

材料和方法

1 動物

SPF級SD大鼠70只，2月齡，體重(210±10)g，雌雄各半，購買于遼寧長生生物技術有限公司，許可證號為SCXK(遼)2010－0001，用于制備含藥血清。提取和培養骨髓間充質干細胞采用上述同種雄性大鼠2只。

2 藥物

中藥飲片購買于遼寧中醫藥大學附屬第一醫院，左歸丸(成分:熟地黃24 g、炒山藥12 g、枸杞子12 g、山茱萸12 g、鹿角膠12g、菟絲子12 g、牛膝9 g、龜板膠12 g)、右歸丸(成分:熟地黃24 g、炒山藥12 g、枸杞子12 g、山茱萸12 g、鹿角膠12 g、菟絲子12 g、當歸 9 g、肉桂 6 g、杜仲 9 g、附子 6 g)、共同藥方(成分:熟地黃24 g、炒山藥 12 g、枸杞子12 g、山茱萸12 g、鹿角膠12 g、菟絲子12 g)、滋陰藥方(熟地黃24 g、炒山藥 12 g、枸杞子 12 g、山茱萸 12 g、龜板膠12 g)和補陽藥方(肉桂6 g、杜仲9 g、附子6 g、鹿角膠12 g、菟絲子12 g)，以上5種藥方自制成水煎劑，生藥量為1 g·mL－1;戊酸雌二醇片(補佳樂;Delpharm Lille S．A．S，國藥準字 J20080036)。

3 試劑與儀器

改良型α-MEM培養液和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(HyClone);胰酶(Sigma);CD29抗體、CD45抗體、CD11b/c抗體和CD90抗體(Biolegend);Anti-CollagenⅠ抗體(博奧森);Anti-GAPDH抗體(中杉金橋);Anti-Cbfα1/Runx2抗體(Abcam);realtime RT-PCR試劑盒(TaKaRa);引物委托TaKaRa公司設計合成，Cbfα1上游引物5'-ATGACGGTAACCACAGTCCCATC-3'，下游引物 5'-ATGACGGTAACCACAGTCCCATC-3'，擴增長度為86 bp;ColⅠ上游引物5'-AGCAGACGGGAGTTTCACCTC-3'，下 游 引 物 5'-TGTCTTCTTGGCCATGCGTCA-3'，擴 增長度為 193 bp;GAPDH上游引物5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'，下游引物 5'-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3'，擴增長度為150 bp。3111二氧化碳培養箱(Thermo)，FACSCalibur流式細胞儀(BD)，BioSpec-nano型紫外可見分光光度計(島津)，Mx3000P型Real-Time PCR儀(Agilent)。

4 主要方法

4．1 含藥血清制備與實驗分組 將70只大鼠隨機分為7組:左歸丸組(ZGW)、右歸丸組(YGW)、共同藥組(GTY)、滋陰藥組(ZYY)、補陽藥組(BYY)、補佳樂組(BJL)和空白對照組，每組10只，雌雄各半。按每kg體重大鼠的給藥量為人的6．3倍計算，并且每天給大鼠灌胃量為正常人用藥量的2倍，每天早晚各灌胃1次，空白對照組灌服蒸餾水。于第4天給藥2 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，采用大鼠腹主動脈取血，靜置2 h 后，2 500 r·min－1、4 ℃離心20 min，收集血清，56℃水浴滅活30 min，分裝后，－86℃保存。實驗分為8組:ZGW+YDJ組、YGW+YDJ組、GTY+YDJ組、ZYY+YDJ組、BYY+YDJ組、BJL+YDJ組、YDJ組和 control組，見表1。

表1 實驗分組Table 1．Experimental groupsing

4．2 BMSCs分離培養 將2月齡大鼠脫頸處死后，75%乙醇浸泡15 min后，移入超凈臺，在無菌條件下取下雙側股骨和脛骨，剪掉骨的兩端，暴露骨髓腔后，用5 mL含青、鏈霉素的α-MEM培養液反復沖洗骨髓腔至平皿中，直至骨的顏色變白，收集平皿中液體到離心管中，1 000 r·min－1離心 3 min，倒掉上清液，用含10%FBS的α-MEM培養液重懸細胞后，轉入25 cm2培養瓶，再移到CO2培養箱培養，傳至第4代細胞，用于以下實驗。

4．3 BMSCs鑒定 第4代細胞經PBS洗3遍，胰酶消化，再用1 mL PBS重懸后轉入1．5 mL EP管中，1 500 r·min－1離心 5 min，1 mL PBS 重懸，細胞濃度為1×109cells·L－1，分別加入 CD29抗體、CD45 抗體、CD11b/c抗體和 CD90抗體，避光，4℃孵育30 min，再用PBS清洗1次，0．3 mL PBS再次重懸，上流式細胞儀檢測。

4．4 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色采用改良鈣鈷法，P4細胞經胰酶消化后，以5×107cells·L－1接種于 24 孔培養板(1 mL/well)，4 d(根據前期繪制生長曲線的情況)后饑餓培養，24 h后棄饑餓液，分別加入8種干預液1 mL，每組3復孔，繼續培養9 d后，棄原培養液，95%乙醇固定15 min，干燥后;加入ALP孵育液，于37℃孵育4 h;流水洗10 min;2%硝酸鈷作用5 min;蒸餾水洗片刻;1%硫化銨水溶液(現配用)處理1 min;蒸餾水沖洗。顯微鏡觀察。

4．5 礦化結節觀察 采用茜素紅染色法，接種細胞同方法4．4項，培養14 d(每3d換液1次)后棄孔中的培養液，PBS洗2次，95%乙醇固定10 min;PBS洗3次;0．1%茜素紅-Tris-HCl 37℃孵育30 min;自來水沖洗，室溫干燥。顯微鏡觀察。

4．6 核心結合因子α1(core binding factor alpha 1，Cbfα1)和Ⅰ型膠原(collagen typeⅠ，ColⅠ)mRNA檢測 采用RT-PCR法，第4代BMSCs接種于8個25 cm2培養瓶，4 d后饑餓，24 h后加各組培養液6 mL，9 d(每3 d換液1次)后將細胞用 PBS洗3遍后，每瓶中加入500μL RNAiso Plus，刮取細胞，吸入預冷的1．5 mL EP中，用RNAiso Plus試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度A260/A280在1．8～2．2之間。去除基因組DNA，反轉錄RT反應和染料法(SYBR Green I)相對定量分析，反轉錄按如下條件反應:37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。實時定量PCR儀中按如下條件反應:95℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個循環。

4．7 Cbfα1和ColⅠ蛋白檢測 采用 Western blotting法，細胞接種及含藥血清干預同方法4．6項，9 d后，棄培養液，4℃預冷的PBS洗3遍，甩干;每瓶細胞加入裂解液100μL，細胞刮至瓶底一角，冰上靜置30 min;收集至預冷的離心管中，12 000 r·min－1、4℃ 離心10 min，取上清;BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白變性后，每孔上樣20μL，電泳后轉膜3 h，Ⅰ抗孵育1 h后，4℃過夜，次日Ⅱ抗孵育1 h后，暗室中加入ECL發光液，曝光30 min，掃描圖像并分析結果，計算目的蛋白與內參照GAPDH條帶的吸光度比值，再各組比較。

5 統計學處理

采用SPSS 13．0軟件處理，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較用One-way ANOVA，方差齊采用LSD檢驗，方差不齊采用 Tamhane's方法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 BMSCs形態學觀察

細胞接種于培養瓶后，24 h后可見部分細胞貼壁，呈圓形較多，透亮，3 d后可見大部分細胞已貼壁，有突觸伸出，細胞多呈菱形或多角形，可進行首次換液，10～12 d細胞達80%融合，可進行首次傳代，第4代細胞多呈紡錘形生長，排列為漩渦狀，見圖1。

Figure 1．Morphology of BMSCs(×100)．A:P0 BMSCs at 10 d;B:P4 BMSCs at 5 d．圖1 BMSCs的形態

2 BMSCs的流式細胞術鑒定

經流式細胞術檢測，CD90(70．61%)和 CD29(98．38%)表達為陽性，CD11b/c(11．23%)和 CD45(7．64%)表達為陰性，見圖2。

3 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs ALP活性的影響

與control組比較，其它組ALP活性均增強，差異有統計學意義(P＜0.05)。與YDJ組比較，ZGW+YDJ和ZYY+YDJ組ALP活性增強，BYY+YDJ和BJL+YDJ組ALP活性降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。與 ZGW+YDJ組比較，YGW+YDJ、GTY+YDJ、BYY+YDJ和 BJL+YDJ組 ALP活性降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖3。

Figure 2．Identification of BMSCs by flow cytometry．A:PerCP/Cy5．5 anti-CD90;B:APCanti-CD29;C:PE anti-CD11b/c;D:PE anti-CD45．圖2 BMSCs的流式細胞術鑒定

Figure 3．The ALP activity in BMSCs induced by sera containing Zuogui pill，Yougui Pill and their disassembled prescriptions(×100)．A:ZGW+YDJ;B:YGW+YDJ;C:GTY+YDJ;D:ZZY+YDJ;E:BYY+YDJ;F:BJL+YDJ;G:YDJ;H:control．Mean ±SD．n=3．*P ＜0.05 vs control;▲P ＜0.05 vs YDJ;★P ＜0.05 vs ZGW+YDJ．圖3 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs ALP活性的影響

4 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs礦化結節的影響

與control組比較，其它組礦化結節均有增加，差異有統計學意義(P＜0.05)。與YDJ組比較，ZGW+YDJ和ZYY+YDJ組礦化結節均有增加，BYY+Y DJ和BJL+YDJ組礦化結節減少，差異有統計學意義(P＜0.05)。與 ZGW+YDJ組比較，YGW+YDJ、GTY+YDJ、BYY+YDJ和 BJL+YDJ組礦化結節均有減少，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖4。

5 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs Cbfα1 mRNA表達的影響

與control組比較，其它組Cbfα1 mRNA表達均上調，差異有統計學意義(P＜0.05)。與YDJ組比較，ZGW+YDJ、YGW+YDJ、GTY+YDJ 和 ZYY+YDJ組Cbfα1 mRNA表達均上調，差異有統計學意義(P＜0.05)。與ZGW+YDJ組比較，YGW+YDJ、GTY+YDJ、BYY+YDJ和 BJL+YDJ組 Cbfα1 mRNA表達均下調，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖5。

Figure 5．Cbfα1 mRNA expression in BMSCs induced by sera containing Zuogui pill，Yougui pill and their disassembled prescriptions．A:ZGW+YDJ;B:YGW+YDJ;C:GTY+YDJ;D:ZZY+YDJ;E:BYY+YDJ;F:BJL+YDJ;G:YDJ;H:control．Mean ± SD．n=3．*P ＜0.05 vs control;▲P ＜0.05 vs YDJ;★P ＜0.05 vs ZGW+YDJ．圖5 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs Cbfα1 mRNA表達的影響

6 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs ColⅠmRNA表達的影響

與control組比較，除BYY+YDJ組外，其它組均能上調ColⅠmRNA表達，差異有統計學意義(P＜0.05)。與YDJ組比較，ZGW+YDJ和ZYY+YDJ組能上調ColⅠmRNA表達，BBY+YDJ和 BJL+YDJ組下調ColⅠmRNA表達，差異有統計學意義(P＜0.05)。與 ZGW+YDJ組比較，YGW+YDJ、GTY+YDJ、BYY+YDJ和 BJL+YDJ組下調 ColⅠmRNA 表達，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖6。

7 左、右歸丸及其拆方含藥血清對 BMSCs的Cbfα1蛋白表達的影響

與control組比較，除 BYY+YDJ組外，其它組Cbfα1蛋白表達升高，差異有統計學意義(P＜0.05);與YDJ組比較，ZGW+YDJ和 ZYY+YDJ組Cbfα1蛋白表達升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。與 ZGW+YDJ組比較，YGW+YDJ、GTY+YDJ、BYY+YDJ和 BJL+YDJ組 Cbfα1 蛋白表達降低，而ZYY+YDJ組Cbfα1蛋白表達升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖7。

Figure 6．ColⅠmRNA expression in BMSCs induced by sera containing Zuogui pill，Yougui pill and their disassembled prescriptions．A:ZGW+YDJ;B:YGW+YDJ;C:GTY+YDJ;D:ZZY+YDJ;E:BYY+YDJ;F:BJL+YDJ;G:YDJ;H:control．Mean ±SD．n=3．*P ＜0.05 vs control;▲P ＜0.05 vs YDJ;★P ＜0.05 vs ZGW+YDJ．圖6 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs ColⅠmRNA表達的影響

Figure 7．Cbfα1 protein expression in BMSCs induced by sera containing Zuogui pill，Yougui pill and their disassembled prescriptions．A:ZGW+YDJ;B:YGW+YDJ;C:GTY+YDJ;D:ZZY+YDJ;E:BYY+YDJ;F:BJL+YDJ;G:YDJ;H:control．Mean ± SD．n=3．*P ＜0.05 vs control;▲P ＜0.05 vs YDJ;★P ＜0.05 vs ZGW+YDJ．圖7 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs Cbfα1蛋白表達的影響

8 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs ColⅠ蛋白表達的影響

與control組比較，除 BYY+YDJ組外，其它組Col 1蛋白表達升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。與YDJ組比較，ZGW+YDJ和ZYY+YDJ組Col 1蛋白表達升高，BYY+YDJ組ColⅠ蛋白表達降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。與ZGW+YDJ組比較，GTY+YDJ、BYY+YDJ和 BJL+YDJ組 ColⅠ蛋白表達降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖8。

Figure 8．ColⅠprotein expression in BMSCs induced by sera containing Zuogui pill，Yougui pill and their disassembled prescriptions．A:ZGW+YDJ;B:YGW+YDJ;C:GTY+YDJ;D:ZZY+YDJ;E:BYY+YDJ;F:BJL+YDJ;G:YDJ;H:control．Mean ± SD．n=3．*P ＜0.05 vs control;▲P ＜0.05 vs YDJ;★P ＜0.05 vs ZGW+YDJ．圖8 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs ColⅠ 蛋白表達的影響

討 論

中醫理論認為，“腎生骨髓”，“腎充則髓實”(《素問·陰陽應象大論》)。腎藏精，精生髓，髓養骨，這是“腎主骨”的理論基礎［6］。精是構成人體生命活動的有形精微物質，是構成人體和維持人體生命活動的最基本物質。BMSCs是一種多潛能細胞，主要存在于骨髓中，在個體發育成熟過程的特定狀態下及組織修復過程中起著重要的作用，其功能不足則會導致生長發育障礙。目前研究認為腎精與BMSCs存在一定的相關性［7］，BMSCs對骨的生長發育及功能的維持起著非常重要的作用。左、右歸丸是中醫補腎益精法經典代表方，均出自《景岳全書·新方八陣》。左歸丸用于肝腎精血虛損，從《內經》“精不足者，補之以味”而立法，《素問·陰陽應象大論》云:“形不足者，溫之以氣;精不足者，補之以味。”方中熟地黃、山藥、山茱萸補肝腎益陰血，龜板膠、鹿角膠合用可峻補精血，調和陰陽，再加菟絲子、枸杞子平補肝腎，牛膝以壯腰膝;右歸丸治命門火衰，真陽虛弱，在附子、肉桂、鹿角膠、菟絲子、杜仲等溫補腎陽之中，又用大量的熟地黃配合山藥、山茱萸、枸杞子滋陰補腎，填精補髓，于陰中求陽，滋陰生氣。同時，現代研究發現左、右歸丸可以作為“補腎”的代表方促進BMSCs的成骨分化。但由于2方補腎填精的機制不同，所以2方在促進BMSCs成骨分化方面是否有不同之處值得探討。補佳樂戊酸雌二醇片是臨床常用的一種雌激素，可以抑制骨的吸收以促進骨的形成［8］，而現代研究發現左、右歸丸也可以通過發揮其類雌激素樣的作用促進骨形成［9-10］，故本實驗選用補佳樂為陽性對照藥，與左、右歸丸及其拆方分別誘導BMSCs成骨分化。

本實驗首先對體外分離培養的BMSCs進行鑒定，BMSCs因其有貼壁性的特點，傳至第4代后細胞純化，表達多種細胞的表面標志［11-13］，如 CD29、CD90、CD71、CD44、CD105、CD106 等，以上均是 BMSCs的重要表面標志物，同時又由于它屬于非造血類細胞，不表達 CD34、CD45、CD11b、CD14 等表面抗原，經流式細胞術檢測CD29和CD90表達陽性，CD11b/c和CD45表達陰性，故 BMSCs得以鑒定。目前對于BMSCs的成骨分化研究很多，這一過程受諸多因素的影響［14-15］，如ALP是成骨細胞所分泌的一種酶蛋白，ALP活性的高表達是成骨細胞分化的標志，礦化結節的形成也是成骨的另一標志［16-17］，Cbfα1是間充質干細胞向成骨細胞分化的特異性轉錄調節因子，它的表達是成骨細胞開始分化的標志［18-19］。ColⅠ是礦化骨中唯一的膠原類型，代表成骨過程中有機基質的形成［20-21］。實驗結果表明左歸丸組和滋腎陰藥組均可協同誘導劑誘導BMSCs成骨分化，顯著促進 ALP生成，礦化結節的形成，上調Cbfα1 和 ColⅠmRNA，促進 Cbfα1 和 ColⅠ蛋白的高表達，且優于誘導劑組，而左歸丸組和滋腎陰藥組之間無顯著差異;同時，我們發現右歸丸組、2方共同藥組、補腎陽藥組和補佳樂組對于以上的成骨指標的檢測均不如左歸丸組。由此可見，左歸丸組和滋腎陰藥組協同誘導劑誘導BMSCs成骨分化為佳，進一步說明了其對BMSCs成骨分化的協同作用，以“滋補腎陰”立法的左歸丸組和滋腎陰藥組優于以“溫補腎陽”立法的右歸丸組和補腎陽藥組，但二者對于BMSCs成骨分化過程中是否作用于不同的信號轉導通路有待進一步研究。