觀察三氯六氨絡合鈷對DNA凝聚的影響

陳文娟，何林李，程順華，楊光參，王艷偉

（溫州大學 物理與電子信息工程學院，浙江 溫州325035）

1 引 言

動態光散射技術（Dynamic light scattering，DLS）是一種建立在顆粒動力學信息與其發出的散射光的漲落關系上的方法，能有效測量亞微米和納米級顆粒粒度［1］.自從Cummins等人在1964年首次成功將DLS應用于實驗研究中后，人們陸續將目光投注在DLS上，DLS技術得到不斷補充完善并發展為成熟的測量技術.在當前現有的顆粒粒度檢測技術中，DLS技術具有準確、快速、可重復性好、檢測時間短、成本低、對樣品量要求很小等優點，被廣泛應用于顆粒測量、生物工程、藥物學以及微生物等領域，尤其在高分子與生物大分子的溶液特性、分子內部運動狀態及生物大分子的凝聚等領域顯示了廣泛的應用前景［2-4］.

原子力顯微鏡（AFM）克服了掃描隧道顯微鏡（STM）對樣品要求的限制，擴大了應用范圍［5］.AFM利用微懸臂上的探針做力傳感器，針尖與樣品之間作用力的變化使懸臂震動，導致射到懸臂上面的激光的反射光發生偏轉，探測器將偏轉量記錄下轉化成電信號，在控制器做信號處理轉換成樣品形貌圖像，AFM在各研究領域特別是生物大分子（DNA、蛋白）及特性（DNA凝聚等）研究中得到廣泛應用.

DNA凝聚是1個或者幾個DNA分子由自由伸展狀態坍縮到更加緊湊的有序結構的過程.導致DNA凝聚的凝聚劑有很多，比如三價或者更高價的離子、陽離子多肽、組蛋白、乙醇等［6］.DNA凝聚在DNA包裝成染色質的過程有很廣泛的生物應用性，是基因傳輸與轉錄中重要的運輸工具［7-9］.一般認為，多價離子導致DNA凝聚的凝聚機制是多價離子中和了DNA磷酸根的負電荷，從而使DNA片段的排斥力減小，靜電吸引力增強，引起DNA鏈的坍縮，從而形成更加緊湊的結構.物理學家研究DNA性質及DNA與凝聚劑的作用機制的的重要研究手段有DLS技術［10］及 AFM 技術［11］等，通過測量其凝聚后粒徑的大小及凝聚的形態變化來分析凝聚劑與DNA的相互作用機制及凝聚過程的粒徑分布模式等.

我們在近現代物理實驗教學中用DLS及AFM技術測量DNA與凝聚劑相互作用后粒徑大小及凝聚過程形態變化和分布模式等為設計內容，開設了綜合設計型研究前沿實驗，實驗中所用樣品，可由學生自己動手準備，這不但有助于學生熟悉、掌握基礎的樣品準備方法，還能更好地掌握DLS及AFM技術的基本原理和應用.

2 實驗原理

2.1 DLS的實驗原理

DLS是測量光強隨時間起伏變化規律的手段，如果納米粒子在溶液中處于無規則的布朗運動，這種無規則的運動使散射光強度在時間上表現為平均光強附近的隨機漲落，它是由各個散射粒子發出的散射光場相干疊加而成的.懸浮液中的顆粒由于受到了周圍做布朗運動分子的不斷撞擊，而不停地進行隨機運動，在激光的照射下，運動顆粒的散射光強也將產生隨機的波動，而且波動的頻率與顆粒的大小有關，在一定角度下，顆粒越小，漲落越快.通過計算漲落變化的時域自相關函數，就可以得到影響變化的顆粒粒徑信息.因此，DLS法也稱為光子相關光譜法［12］.

當一束單色平行光照射溶液樣品時，遇到做布朗運動的球形粒子，產生散射光，散射光強隨時間漲落，顆粒運動的速度越快，散射光強變化就越快，光強的自相關函數為

其中，A 為光強自相關函數G（2）（τ）的基線，β為約束信噪比常量，A和β都與實驗條件有關，Γ為瑞利線寬.除了布朗運動能夠導致散射光強隨時間漲落外，其他如環境等因素也能夠影響顆粒散射光強的漲落.在存在布朗運動為唯一因素時，

式中，D為顆粒的平移擴散系數，q為散射光波矢的幅值，q＝sin，其中n為溶劑折射率，θ為散射角，λ0為入射光在真空中波長.如果樣品顆粒為球形，則根據Stokes-Einstein理論可以得到D的計算公式為

其中kB為玻爾茲量常量，T為絕為溫度，η為溶液黏度，d為粒子直徑.通過（3）式可以計算出被測樣品顆粒的粒徑.

2.2 AFM的實驗原理

在AFM的系統中，使用微小懸臂來感測針尖與樣品之間的相互作用，此作用力會使微懸臂擺動，當擺動形成時，會使照在懸臂末端的激光的反射光位置改變而造成偏移量，激光檢測器會記錄此偏移量，也會把此時的信號傳給反饋系統，以利于系統做適當的調整，最后再將樣品的表面特性以影像的方式呈現［13］.

原子力顯微鏡與樣品間的相互作用以范德華力為主，其作用勢能一般用Lennard-Jones勢能函數表示：

式中，r是兩原子的核間距，δ是勢能為0時原子核間距，ε是勢阱深度，是勢能曲線上最低點勢能的絕對值.當懸臂尖端的原子與樣品靠近，開始時吸引力起主導作用，隨著距離的減小，二者之間的吸引力與排斥力將趨于平衡，當兩原子進一步靠近時，范德華力以斥力為主.

3 實驗材料與方法

3.1 DLS實驗的材料與方法

實驗選用的λ-DNA購于New England Biolabs公司，原始濃度為500mg／L，保存液為1×TE緩沖液（10mmol／L Tris-HCl和 1mmol／L EDTA，pH＝8.0）.用于配置樣品的超純水是由美國Millipore公司超純水系統處理生產的.凝聚劑三氯六氨絡合鈷購買于Sigma公司，使用時用超純水稀釋，最終濃度分別為1，2.5，5，7.5，10，15μmol／L.最后樣品中λ-DNA 的最終濃度為1mg／L.

DLS實驗使用的儀器為英國馬爾文的Zetasizer Nano-ZS90.由 He-Ne激光器（波長為632.8nm）發出的光入射到裝有DNA與鈷離子混合溶液的矩形高純度石英樣品池，在散射角為90°的方向用探測器接收散射光，散射光經信號數字相關器處理后最終被送到計算機進行數據分析和計算.實驗條件：樣品室內溫度25℃，溶劑水的折射率n＝1.330，水的黏度η＝0.887 2mPa·s.樣品采樣持續時間為300s.實驗結果用給定的軟件Zetasizer Nano-ZS90software輸出.

3.2 AFM實驗的材料與方法

λ-DNA及超純水的來源同上，λ-DNA的最終濃度也為1mg／L.云母片切割成邊長為1cm的正方形，用雙面膠粘在圓形鐵片上，利用其作為襯底制備樣品.凝聚劑三氯六氨絡合鈷用超純水稀釋，最終濃度分別為30，60，100，150μmol／L.AFM型號為島津公司的SPM-9600，探針購買自Nanoworld，懸臂彈性系數為42N／m，共振頻率為320kHz.模式采用氣態的輕敲模式，圖像采集的掃描頻率為2Hz，像素為512×512.圖片使用時經過平滑去噪處理以提高對比度.

實驗過程首先用超純水把鈷離子稀釋到預計濃度，混合均勻后加入DNA，使DNA的最終濃度為1mg／L.用移液器取約15μL稀釋的DNA溶液，滴在新解理的云母片上面，沉積3min，然后用約200μL純水沖洗，氮氣吹干，放入干燥器2h以上，待掃描.

4 結果與討論

4.1 DLS的實驗結果與討論

在DLS實驗過程中通過改變樣品的培育時間與Co（NH3）3＋6的濃度來觀察DNA與多價離子相互作用后粒徑的改變情況.由于多價離子能夠使DNA發生凝聚，所以混合后的粒徑就會變小，具體的實驗結果通過給定的軟件輸出，直接給出樣品的半徑，相關的實驗結果如表1所示，其中每個粒徑（半徑）為5次測量的平均值，每次測量值都是儀器顯示的統計平均的最終結果，分析模式采用單峰的分析模式，而且有一定的峰寬.所有數據的測量不確定度為±3nm.

表1 粒徑測量數據

圖1 不同樣品培育時間的Co（NH3）3＋6粒徑-濃度曲線

圖2 不同Co（NH3）3＋6 濃度的粒徑-培育時間曲線

由圖1可以看出培育時間為15min時，增大Co（NH3）3＋6濃度，測得的λ-DNA粒徑會慢慢減小，然后趨于穩定.再進一步增加培育時間為30min時，λ-DNA 的粒徑隨著 Co（NH3）3＋6濃度的增加會相對較快地趨于穩定.當培育時間為120min時，隨著Co（NH3）3＋6濃度的增加，λ-DNA的粒徑幾乎不會發生太大改變，而是與Co（NH3）3＋6濃度很小時的粒徑相似，只有很小的變化.通過3條曲線對比可知，培育時間120min后，DNA幾乎處于凝聚狀態，粒徑已經變化不大.由圖1的結果可知Co（NH3）3＋6導致的DNA凝聚過程需要一定的反應時間，作用過程中Co（NH3）3＋6逐漸與DNA磷酸基上的負電荷進行中和，這個過程并不是極短時間內完成的.所以樣品培育時間越長，DNA鏈上負電荷被中和越多，DNA凝聚就越嚴重，當培育時間達120min時，DNA在很低的Co（NH3）3＋6濃度下，就會處于凝聚狀態，所以DNA的粒徑隨著培育時間的再增加不會發生大改變.而且在粒徑的分析時采用單峰的分布模式進行處理，即認為在同一個多價離子濃度下，如果樣品混合均勻、操作正確，所有DNA從自由舒展構象到凝聚構象變化中處于同一過程，當然有個別情況構象不相同，這就要考慮單峰分布模式有一定峰寬.實驗中取單峰分布情況的數據，最后統計平均最終粒徑結果.

從圖2中可以看出，Co（NH3）3＋6濃度低于7.5μmol／L時，不同培育時間測得的λ-DNA粒徑相差較大，DNA粒徑隨著培育時間的增加而慢慢減小，在培育60min后，都會慢慢趨于穩定.當Co（NH3）3＋6濃度提升到大于等于7.5μmol／L時，不同培育時間的λ-DNA粒徑的差距較小，曲線開始靠近，DNA粒徑相差不大，在培育時間很短的情況下粒徑就幾乎達到33nm.可見培育時間作為影響λ-DNA凝聚的一個因素外，凝聚劑的濃度也是影響DNA凝聚的重要因素.高濃度的凝聚劑能夠促使磷酸基上的負電荷更快地被中和，所以達到穩定的最小粒徑需要更少時間.

4.2 AFM的實驗結果與討論

在AFM實驗中，取了培育時間為30min的4個鈷離子濃度進行實驗，直接觀察多價離子與DNA作用后凝聚形態的變化情況，如圖3所示，可見鈷離子導致DNA凝聚的最終形態一般是花一樣的構象.

由圖3可以看出：隨著鈷離子濃度的增加，DNA的凝聚越來越嚴重.此部分實驗與DLS比較導致DNA凝聚的鈷離子濃度要偏大，因為在AFM實驗中云母表面帶負電也會中和多價離子，所以多價離子必須一部分被吸附在云母表面，其余部分才用來凝聚DNA，那么導致DNA凝聚的離子濃度就要更大才有效果.而且用AFM的實驗結果進一步證明DLS中粒徑的分析采用單峰的分布模式是正確的，也就是說DNA從松散構象到凝聚構象轉化過程中一般所有的DNA都處于同一形態，如圖3所示.也有個別情況構象不同，如圖3（a），可以看見沒有凝聚的自由舒展的DNA，原因可能是操作過程中水沖或者氮氣吹所導致，但是基本構象不會相差很大，即單峰的分析模式還是要考慮一定的峰寬，前面的DLS實驗結果就是采用單峰分析模式的最終統計平均結果，一般樣品分布均勻，操作規范，不會出現同一凝聚劑濃度下一部分處于全松散，一部分處于高度凝聚狀態的情況.

在多價陽離子與DNA作用的過程中，Co（NH3）3＋6只有在中和DNA磷酸骨架負電荷達到89%以上才能引起DNA凝聚.實驗數據說明該過程受凝聚劑濃度和樣品培育時間等因素的影響，結果用DLS技術得到充分的證明.多價離子導致的DNA凝聚過程是快速而且同步的過程，即結構的轉變是在同一時間、同一濃度下基本一致.AFM的圖像直觀地顯示出這一現象.當然使用DLS及AFM技術進行粒度測量和形態的測量時不可避免地受到噪聲影響，最終測得的顆粒粒徑和形態都存在一定的噪聲誤差.如樣品池的使用，樣品的均勻混合度、環境溫度的控制和儀器的事先預熱及實驗的操作等都不可避免地引起實驗的誤差，在實驗過程中都要引起注意.

圖3 不同Co（NH3）3＋6濃度下DNA凝聚的AFM圖像

5 結束語

用DLS及AFM技術探究Co（NH3）3＋6誘導DNA凝聚過程中粒徑變化和凝聚形態變化，實驗結果表明影響DNA凝聚的因素有樣品的培育時間和凝聚劑的濃度等.該方法在醫學、海洋生物學、物理、化學等科學研究領域已得到深入應用.將該實驗引入近代物理實驗教學中，可以提高學生的動手能力和綜合分析能力，同時有助于拓寬學生的知識層面，提升學生對物理學和生物學交匯領域的認知.

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