RUNX3蛋白在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義

李朦，劉震，魏力

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院婦科，沈陽(yáng) 110032）

宮頸癌是最常見(jiàn)的女性高發(fā)惡性腫瘤之一，近年來(lái)宮頸癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，而且發(fā)病有年輕化趨勢(shì)［1］。自上世紀(jì)70年代后，宮頸癌的病因?qū)W研究取得了重大進(jìn)展，目前已明確高危人乳頭瘤病毒（human papillomavirous，HPV）感染［2］是宮頸癌發(fā)生的重要因素，同時(shí)還存在其他內(nèi)源性和外源性因子的共同參與作用，其中抑癌基因功能的喪失和癌基因的表達(dá)是細(xì)胞癌變的分子基礎(chǔ)。人類(lèi)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（human runt related transcription factor 3，RUNX3）是Levanon等于1994年首次發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的腫瘤抑制基因，參與胚胎發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控。RUNX3是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的下游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，其信號(hào)紊亂將導(dǎo)致許多腫瘤的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)表明，RUNX蛋白可指導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中激活的Smad復(fù)合物，加強(qiáng)其與靶位點(diǎn)的結(jié)合強(qiáng)度并激活靶基因，從而對(duì)細(xì)胞的分化、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡和惡性轉(zhuǎn)化起作用［3］。目前，RUNX3 蛋白在肺癌［4］、胰腺癌［5］、肝細(xì)胞癌［6］等多種惡性腫瘤［7］中均有不同程度的轉(zhuǎn)錄失活或表達(dá)下調(diào)，而在宮頸癌中的研究不多，其在宮頸癌中表達(dá)的意義及在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能的作用機(jī)制尚不清楚。為此，本研究采用免疫組化方法檢測(cè)RUNX3蛋白在正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和宮頸癌組織中的表達(dá)并探討其臨床意義，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與材料

收集2007年1月至2011年12月于我院保存的經(jīng)10%甲醛溶液固定、石蠟包埋的宮頸組織標(biāo)本101例，患者年齡為26～63歲。其中宮頸癌標(biāo)本48例，CIN標(biāo)本33例，正常宮頸標(biāo)本20例。按照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）2009年宮頸癌標(biāo)準(zhǔn)分期：Ⅰ～ⅡA期20例，ⅡB～Ⅳ期28例；病理分級(jí)：高分化25例，中低分化23例；病理分型：鱗癌44例，腺癌4例。其中20例Ⅰ～ⅡA期的宮頸癌標(biāo)本均由患者行根治性全子宮切除術(shù)伴淋巴結(jié)清掃治療獲得，其余28例ⅡB～Ⅳ期的宮頸癌標(biāo)本均為門(mén)診宮頸活檢獲得；術(shù)后病理證實(shí)存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者9例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者11例。根據(jù)細(xì)胞異型程度及病變累及范圍進(jìn)行CIN分級(jí)，其中CINⅠ16例、CINⅡ～Ⅲ17例。有病變的宮頸中HPV陽(yáng)性60例，陰性21例。所有CIN及宮頸癌病患者術(shù)前均未進(jìn)行放射、化學(xué)或生物治療，正常宮頸均來(lái)源于因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)且術(shù)后病理證實(shí)為慢性宮頸炎的患者。

1.2 免疫組化檢測(cè)

RUNX3兔抗人抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。SP試劑盒為康為世紀(jì)公司生產(chǎn)。免疫組化采用SP法。石蠟包埋組織常規(guī)脫蠟后PBS緩沖液沖洗，枸櫞酸鹽加熱型抗原修復(fù)后冷卻至室溫備用。用RUNX3抗體標(biāo)記組織切片（1∶150），具體步驟參照試劑盒說(shuō)明，然后經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染。以PBS作為空白對(duì)照，已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 免疫組化結(jié)果判定

采用半定量積分法判定結(jié)果，RUNX3蛋白主要在胞質(zhì)中表達(dá)，以胞質(zhì)出內(nèi)現(xiàn)黃色至棕褐色顆粒判定為陽(yáng)性。先按染色強(qiáng)度計(jì)分：0分，無(wú)色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。再按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：0分，陰性；1分，陽(yáng)性細(xì)胞＆lt;10%；2分，10%～＆lt;50%；3分，50%～＆lt;75%；4分，≥75%。兩項(xiàng)得分相乘后判定免疫組化結(jié)果，陰性（-）：0～4分；弱陽(yáng)性（+）：4～5分；中度陽(yáng)性（++）：6～8分；強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：9～12 分。

1.4 病理學(xué)分級(jí)判定

G1級(jí)：非鱗狀或非桑葚樣生長(zhǎng)類(lèi)型＆lt;5%；G2級(jí)：非鱗狀或非桑葚樣生長(zhǎng)類(lèi)型為5%～＆lt;50%；G3級(jí)：非鱗狀或非桑葚樣生長(zhǎng)類(lèi)型≥50%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，采用χ2檢驗(yàn)分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果。P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

RUNX3蛋白在有病變的宮頸組織中表達(dá)較正常宮頸低，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05）。不同病變程度宮頸組織中，RUNX3蛋白表達(dá)在CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宮頸癌中呈下降趨勢(shì)。早期（Ⅰ～ⅡA期）宮頸癌行手術(shù)治療，術(shù)后病理證實(shí)為宮頸鱗狀細(xì)胞癌、宮頸腺癌的宮頸組織中RUNX3蛋白表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；隨著臨床分期期別的增高及病理分級(jí)的增高，RUNX3蛋白的表達(dá)呈下降趨勢(shì)（P＆lt;0.05）；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織RUNX3蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高（P＆lt;0.05）；RUNX3蛋白表達(dá)在不同年齡的患者及有和無(wú)高危型HPV感染患者中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1，圖1。

圖1 宮頸組織中RUNX3的表達(dá) ×400Fig.1 Expression of RUNX3 protein in cervix issues ×400

3 討論

RUNX3定位于人染色體1p36.1，廣泛表達(dá)于上皮細(xì)胞、血液細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。大量研究［8］表明，RUNX3可能是新的抑癌基因，廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞中；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)上皮細(xì)胞的增生及人類(lèi)多種惡性腫瘤的形成均有重要調(diào)節(jié)作用。研究［9］發(fā)現(xiàn)，約有60%人胃癌組織中RUNX3蛋白表達(dá)下調(diào)或者缺失，早期胃癌組織約40.9%出現(xiàn)RUNX3蛋白表達(dá)下調(diào)，而進(jìn)展期胃癌組織RUNX3蛋白表達(dá)下調(diào)幾乎達(dá)到87.5%。按正常宮頸—CIN—宮頸癌的發(fā)展，RNX3的表達(dá)存在下降趨勢(shì)符合宮頸癌［10］的發(fā)展變化，RUNX3可能作為一種抑癌基因參與宮頸癌的發(fā)生。還有研究表明RUNX3蛋白不僅對(duì)腫瘤的形成產(chǎn)生作用，而且對(duì)腫瘤的惡性程度、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有影響。有研究選擇食管鱗癌，發(fā)現(xiàn)在早期腫瘤中RUNX3陰性表達(dá)時(shí)腫瘤中淋巴道侵襲能力和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目均明顯增高；RUNX3陰性表達(dá)與腫瘤預(yù)后不良相關(guān)；RUNX3可能是影響預(yù)后的重要因素。

表1 RUNX3蛋白的表達(dá)與宮頸組織中的表達(dá)及臨床病例參數(shù)之間的關(guān)系Tab.1 Relationship between RUNX3 protein expression and clinicopathological parameters and expression in cervix tissues

本研究發(fā)現(xiàn)隨著宮頸病變程度的進(jìn)展，宮頸組織中RUNX3蛋白表達(dá)陽(yáng)性率逐漸下降，從蛋白水平驗(yàn)證了RUNX3基因表達(dá)水平的降低，也從側(cè)面驗(yàn)證了RUNX3是一種抑癌基因，與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符。此外本研究還表明，RUNX3蛋白與臨床病理分級(jí)密切相關(guān)，隨著宮頸癌的發(fā)展，RUNX3陽(yáng)性表達(dá)率下降，進(jìn)一步說(shuō)明了隨著腫瘤的發(fā)展RUNX3表達(dá)下降，提示RUNX3蛋白可能不僅與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)，而且與宮頸癌的病情進(jìn)展也存在密切聯(lián)系。但是本研究?jī)H通過(guò)免疫組化的方法從蛋白水平驗(yàn)證了宮頸組織中RNUX3的表達(dá)情況，并未從基因水平進(jìn)行研究，需要進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌中RUNX3蛋白的表達(dá)與患者的年齡、腫瘤的病理類(lèi)型、高危型HPV感染未見(jiàn)顯著相關(guān)，可能與收集了年齡偏小且惡性程度較高的宮頸癌病例有關(guān)。此外，宮頸鱗狀細(xì)胞癌和腺癌比較RUNX3蛋白表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與收集的宮頸腺癌樣本量少有關(guān)。RUNX3蛋白的表達(dá)與高危型HPV感染是否相關(guān)還需進(jìn)一步研究。

從目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于RUNX3蛋白的大多數(shù)研究中我們可以發(fā)現(xiàn)，其在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后方面的研究正在不斷的深入。RUNX3可能作為一個(gè)惡性腫瘤的生物學(xué)標(biāo)志，同時(shí)可能作為一個(gè)腫瘤的基因治療新靶點(diǎn)。進(jìn)一步探索RUNX3蛋白的表達(dá)調(diào)控及其分子機(jī)制與宮頸病變的關(guān)系，將可能為宮頸癌的診斷、治療提供有價(jià)值的線(xiàn)索。

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