1種新型功能性雜交胰島β細胞系的建立

李曉航，張佳林，李樂，康鐵利，程穎，石蕊，張城碩，趙寧，劉永鋒

（中國醫科大學附屬第一醫院普通外科教研室，肝膽外科暨器官移植科，沈陽110001）

糖尿病是嚴重危害人類健康的常見病之一［1］。胰島移植作為1種治療Ⅰ型糖尿病的方法日益為人們所關注［2］。雖然胰島移植在臨床上取得了突破性進展，但是由于2個或多個供腺才能產生足夠的胰島素，它的推廣應用受到了限制。因此，多渠道獲得胰島是解決胰島不足的當務之急。目前，雖然在胰島獲得方面取得了一些經驗，但在方法上都存在不同程度的缺陷［3～5］。電融合技術在雜交瘤細胞產生單克隆抗體領域已應用多年［6］。理論上，由正常胰島β細胞與永生化細胞融合形成的細胞應該具備永生化細胞系的永生能力及正常胰島β細胞的胰島素生物合成及分泌特性。因此，本研究擬應用電融合技術構建1種與正常胰島β細胞功能相似的大鼠雜交胰島β細胞系。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠，雄性，體質量150～200 g，購自中國醫科大學實驗動物中心。膠原酶Ⅴ型、Ficoll 400、雙硫腙、吖啶橙、碘化丙錠及Hoechst33258染液均購于美國Sigma公司；潮霉素購于瑞士Roche公司；猿猴病毒大 T 抗原基因（SV40 LTag）、胰島素（insulin）、葡萄糖轉運體-2（Glut-2）及葡萄糖激酶（GK）等蛋白抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；ELISA試劑盒購自美國RD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液，于37℃、5%CO2孵箱內培養對照組RIN-m5F細胞。

1.2.2 原代成纖維細胞的獲得及篩選：參照文獻記載的膠原酶消化SD胎鼠皮膚獲得［7］。我們在前期研究中已篩選出永生化成纖維細胞［8］。

1.2.3 胰島細胞的準備及培養：按照文獻［9］記載的膠原酶裂解SD大鼠胰腺獲得新鮮大鼠胰島，加入胰蛋白酶/EDTA和DNA酶制成單細胞懸液。加入含1.28 mmol/L鈣及40 mg/mL牛血清白蛋白緩沖液中復蘇細胞后，將細胞再次懸浮于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中培養。

1.2.4 構建胰島素分泌細胞系：將胰島β細胞及永生化成纖維細胞懸浮于無菌的甘露醇基質的電融合緩沖液中（0.3 mmol/L甘露醇，0.5 mmol/L HEPES，0.05 mmol/L CaCl2，0.1 mmol/L MgSO4，0.05%BSA，pH7.2，濾器過濾除菌，4℃保存備用）。永生化成纖維細胞和胰島β細胞按1︰5比例混合成6×106/mL的1 mL懸浮細胞電融合液，每次取40 μL細胞懸液移至電融合小室（ECM 830，美國BTX公司），調節電融合儀，使場強至1.6 kV/cm，脈沖寬度為40 μs，脈沖個數為3。采用AO/PI熒光染色法判定融合細胞活性＞80%。10 min后，將細胞融合混合液轉移至24孔板培養。

1.2.5 胰島素分泌細胞系的篩選及克隆雜交：將細胞融合混合液分入24孔板。通過ELISA試劑盒測定培養8 d的細胞中胰島素的分泌量，并與正常胰島β細胞進行比較。按照篩選流程，從孔板中篩選具有高胰島素分泌量的細胞進行培養。篩選過程反復進行，最后分離并克隆出具有高胰島素分泌量的細胞進行下一步研究。

1.2.6 細胞形態學觀察：通過胰蛋白酶消化獲得雜交胰島β細胞，使細胞貼壁生長于6孔培養板中（5×105/孔）。PBS清洗2次，離心，棄上清。用2.5%戊二醛4℃固定2 h。觀察細胞超顯微結構。

1.2.7 測定雜交細胞胰島素含量：接種雜交胰島β細胞懸浮液（1×106/孔），過夜細胞貼壁生長，棄培養液，加入500 μL 酸乙醇（1.5%HCl，75%ethanol，23.5%去離子水）吹打，4℃過夜。收集上清測定細胞內的胰島素含量。

1.2.8 雜交胰島β細胞體外功能評價：在37℃孵箱內測定細胞對葡萄糖刺激胰島素釋放反應，測定胰島素含量方法參照文獻［10］。計數2×104個雜交胰島β細胞，在含0.5%胎牛血清以及2.8 mmol/L或16.7mmol/L葡萄糖溶液的1.5 mL RPMI培養基中培養2 h。收集上清液，用ELISA試劑盒測定胰島素含量。胰島素釋放指數通過高糖環境（16.7 mmol/L）與低糖環境（2.8mmol/L）的胰島素含量做比計算獲得。正常胰島β細胞作為陽性對照。

1.2.9 細胞增殖分析：通過生長曲線法觀察雜交胰島β細胞增殖。將雜交胰島β細胞接種于24孔板（1×104/孔），置于37℃、5%CO2孵箱中培養。接種時間記為1 d，之后每天取3孔計數，求平均值，連續測定8d。以培養時間（d）為橫坐標，細胞密度（細胞數/mL）為縱坐標，繪制生長曲線。細胞培養使用不含生長激素的培養基。

1.2.10 半定量RT-PCR分析：使用Trizol提取雜交胰島β細胞總RNA。用逆轉錄試劑盒合成cDNA。在包括1 μg逆轉錄產物、DNA聚合酶和0.4 μmol/L特異引物在內共計25 μg的反應體系內進行DNA擴增。引物序列及RT-PCR參數見表1。通過含有Genefinder（1︰10000）的2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物并記錄。以正常胰島β細胞做為陽性對照。

1.2.11 Western blot：用細胞提取緩沖液裂解細胞，取15 mg蛋白質行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至硝酸纖維薄膜。10%牛奶封閉，加入1︰200～1︰500稀釋的一抗（鼠單克隆抗β-actin抗體，鼠單克隆抗SV40 LTag抗體，鼠單克隆抗胰島素抗體，鼠單克隆抗Glut-2抗體及鼠單克隆抗GK抗體）孵育，加入標記辣根過氧化物酶的抗鼠IgG抗體的二抗，ECL顯色。正常胰島β細胞作陽性對照。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 永生化成纖維細胞的建立

采用有限稀釋法獲得6個永生化成纖維細胞克隆，分別標記為1～6號。永生化成纖維細胞呈多角形或長梭形，與原代成纖維細胞無明顯區別，其增殖能力明顯高于原代成纖維細胞，RT-PCR及Western blot均可檢測永生化成纖維細胞中SV40 Ltag的陽性表達［8］。

2.2 永生化雜交胰島β細胞的建立

電融合3 d后細胞呈長梭形、多邊形或不規則形，貼壁生長（圖1A、1B）。經有限稀釋法篩選出的雜交胰島β細胞克隆呈短梭形或扁圓形，貼壁生長（圖1C、1D）。共篩選出9個雜交胰島β細胞克隆。透射電子顯微鏡下可見正常胰島細胞內有較多胰島素分泌顆粒（圖2A、2B）；雜交胰島β細胞內也可見散在分布的胰島素分泌顆粒（圖2C、2D）。

2.3 永生化雜交胰島β細胞的特征

通過生長曲線觀察雜交胰島β細胞與永生化成纖維細胞之間的增殖能力無明顯區別（P>0.05）（圖3）。雜交和正常胰島β細胞內胰島素含量［分別為（227.40±7.90）和（246.32±8.82）μU/mL］無統計學差異（P>0.05）（圖4）。正常胰島β細胞在低糖和高糖刺激下胰島素分泌量明顯高于雜交胰島β細胞（P<0.05）；但2者在胰島素釋放指數上無明顯差別（表2）。RT-PCR及Western blot均可檢測到雜交胰島 β細胞SV40 LTag的表達（圖5，圖 6）。insulin、Glut-2和GKmRNA表達水平在正常及雜交胰島β細胞中無顯著差異（P>0.05），但均明顯高于RIN-m5F 細胞（P<0.05）（圖 7，圖 8）。Western blot結果相似（圖 9，圖10）。

3 討論

目前，胰島移植是治療糖尿病的最有效手段之一，而胰島短缺是限制臨床胰島移植發展的主要障礙。因此，學者們嘗試建立1種能穩定分泌胰島素的細胞系，以期增加胰島細胞來源。Narushima等［11］利用含有SV40 LTag和人端粒酶逆轉錄酶cDNAs重組逆轉錄病毒載體轉染人胰島β細胞，成功建立“永生化”人胰島β細胞系（NAKT-15），是迄今為止最理想的1種β細胞系，能根據血糖的變化合成和分泌胰島素。把該細胞移植到NOD/SCID小鼠體內，2周后血糖就降至正常水平，且未形成腫瘤，但是否有致瘤性仍有待于進一步研究。McClenaghan等［12，13］通過電融合法將NEDH大鼠胰島β細胞和RIN-m5F細胞進行雜交融合，建立了3種新的克隆細胞系（BRIN-BG5、BRIN-BG7 和 BRIN-BD11），既有無限增殖潛能，又保持了正常胰腺β細胞的重要功能特征。其中功能最好的是BRIN-BD11細胞系，可持續穩定傳代超過50代，胰島素分泌能力及GSIS均較父代RIN-m5F細胞明顯增強，與大鼠正常胰島細胞極相似，且表達高水平Glut-2。體內實驗表明，移植BRIN-BD11可有效控制糖尿病裸鼠的血糖水平［14］。

目前，NAKT-15及BRIN-BD11細胞系功能最為良好和穩定。然而，NAKT-15通過2次病毒感染篩選而來，操作復雜，耗時長，成本高。Barbu等［15］認為即使以感染效率高的腺病毒顆粒感染人或大鼠的胰島細胞團，也僅有30%的胰島細胞被感染，且主要為細胞團外圍的非β細胞。因此，需要將胰島細胞消化成單細胞再進行感染，但胰島單細胞較嬌嫩，且需要感染2次，故對胰島細胞的需求量較大，限制了其應用。McClenaghan首次嘗試應用電融合方法建立雜交胰島β細胞系，取得了可喜的結果，但RIN-m5F為父代細胞之一，有潛在的致瘤性。

自McClenaghan應用電融合建立BRIN-BD11細胞系以后，電融合儀器已不斷改善，能更精確地調節融合參數，控制融合過程。本研究嘗試應用BTX公司ECM830電融合儀融合永生化成纖維細胞和胰島單細胞，經有限稀釋法已獲得9個雜交胰島β細胞克隆。經擴大培養檢測發現雜交胰島β細胞增殖能力明顯改善，與永生化成纖維細胞接近。葡萄糖刺激胰島素分泌試驗證明雜交胰島β細胞對血糖變化較敏感，與正常胰島β細胞相比無顯著差異。其細胞內胰島素含量和正常胰島β細胞相比也無明顯差別，insulin、Glut-2和GK的相對表達量與正常胰島細胞相比也無明顯差別，均顯著高于RIN-m5F細胞，提示此雜交胰島β細胞既具有永生化成纖維細胞體外分裂增殖的能力，又具有胰島β細胞合成分泌胰島素的特性。雖然雜交胰島β細胞對葡萄糖變化有一定敏感性，但分泌的胰島素量較正常胰島β細胞偏少，差異有統計學意義。然而，2種細胞內胰島素含量無明顯差異。提示雜交胰島β細胞內胰島素顆粒的轉運和釋放可能存在缺陷，因而將成為下一步研究的方向之一。

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