HPLC法測定鹽酸拉貝洛爾注射液的含量和有關(guān)物質(zhì)

周怡，鄭金琪（1.國家藥典委員會，北京100061；.浙江省食品藥品檢驗所，杭州310004）

鹽酸拉貝洛爾，化學(xué)名為5-[1-羥基-2-（1-甲基-3-苯丙胺基）-乙基]水楊酰胺鹽酸鹽，是一種兼具α、β受體阻滯作用的抗高血壓藥物[1-2]，主要用于治療各種類型高血壓。本品于1980年在國內(nèi)批準(zhǔn)上市，主要劑型為片劑和注射劑。鹽酸拉貝洛爾分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基和酰胺基，易被氧化和水解，在生產(chǎn)和貯藏過程中亦可能產(chǎn)生降解物。經(jīng)查閱，國家標(biāo)準(zhǔn)[3]和美國藥典（USP）34版[4]標(biāo)準(zhǔn)中均未對鹽酸拉貝洛爾注射液進行有關(guān)物質(zhì)檢查。英國藥典（BP）2011年版[5]采用薄層色譜（TLC）法檢查鹽酸拉貝洛爾注射液的游離羧酸及其他有關(guān)物質(zhì)，TLC法的分離度、靈敏度和準(zhǔn)確度均較低。另外未見對鹽酸拉貝洛爾注射液進行有關(guān)物質(zhì)檢查的文獻報道。國家標(biāo)準(zhǔn)[3]中采用紫外外標(biāo)對照品法測定鹽酸拉貝洛爾注射液的含量。在2011年國家藥典委員會組織的化學(xué)藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高工作中，為嚴格有效地控制藥品的質(zhì)量，筆者參考USP 34版[4]標(biāo)準(zhǔn)，采用改進的高效液相色譜（HPLC）方法，首次研究并建立了HPLC測定鹽酸拉貝洛爾注射液有關(guān)物質(zhì)的方法，并統(tǒng)一了含量測定方法。經(jīng)方法學(xué)考察，該法操作簡單、快速、專屬性強、結(jié)果準(zhǔn)確。

鹽酸拉貝洛爾的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

1 材料

LC-20AT HPLC儀、LC-20AT泵、SPD-M20A二極管陣列檢測器、LC solution色譜工作站（日本Shimadzu公司）。

圖1 鹽酸拉貝洛爾的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 The chemical structure of labetalol hydrochloride

鹽酸拉貝洛爾對照品（批號：100484-201001，純度：99.8%）由中國食品藥品檢定研究院提供；5-[1-羥基-2-（1-甲基-3-苯丙胺基）乙基]水楊酸（游離羧酸）對照品（批號：1335，純度：100.0%）由英國藥典委員會提供；3批鹽酸拉貝洛爾注射液樣品（批號：100101、110101、110102，規(guī)格：50 mg∶10 ml）由江蘇天禾迪賽諾制藥有限公司提供；甲醇為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

供試品溶液：精密量取樣品適量，用流動相稀釋制成每1 ml中含鹽酸拉貝洛爾200 μg的溶液。

對照品溶液：取鹽酸拉貝洛爾對照品約10 mg，精密稱定，置于50 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 色譜條件與測定方法

色譜柱為Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1 mol/L磷酸二氫鈉溶液（55∶45），流速為1.0 ml/min；柱溫為50℃；檢測波長為230 nm。

取鹽酸拉貝洛爾對照品和游離羧酸對照品各適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 ml中含鹽酸拉貝洛爾和游離羧酸各約25、100 μg的溶液，作為混合對照品溶液。取此溶液10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖2A。

圖2 系統(tǒng)適用性試驗高效液相色譜圖A.混合對照品溶液；B.輔料溶液；1.游離羧酸；2.鹽酸拉貝洛爾Fig 2 HPLC chromatograms of system applicability testsA.mixed control solution；B.adjunctive solution；1.free carboxylic acid；2.labetalol hydrochloride

由圖2A可見，鹽酸拉貝洛爾的出峰時間為5.938 min，游離羧酸的出峰時間為5.542 min，兩者的分離度為1.5，符合規(guī)定，理論板數(shù)按鹽酸拉貝洛爾峰計算不低于2000。

2.3 專屬性試驗

2.3.1 輔料試驗。取處方量輔料，依法制備成輔料溶液，進樣10 μl，色譜見圖2B。

由圖2B可知，輔料對主成分測定無干擾。

2.3.2 強制降解試驗。取批號為100101的樣品5份，每份5 ml，分別置于25 ml量瓶中。分別加入3.0 mol/L鹽酸溶液1.0 ml，放置24 h，加3.0 mol/L氫氧化鈉溶液1.0 ml中和后，搖勻，作為酸破壞樣品；加入3.0 mol/L氫氧化鈉溶液1.0 ml，放置24 h，加3.0 mol/L鹽酸溶液1.0 ml中和后，搖勻，作為堿破壞樣品；加入30%過氧化氫溶液1.0 ml，搖勻，放置24 h，作為氧化破壞樣品；在（4500±500）lx光照強度下放置24 h，作為光照破壞樣品；在80℃水浴中加熱4 h，放冷，作為熱破壞樣品。各破壞樣品色譜結(jié)果見圖3。

圖3 降解試驗高效液相色譜圖A.酸破壞樣品；B.堿破壞樣品；C.氧化破壞樣品；D.熱破壞樣品；E.光破壞樣品；1.鹽酸拉貝洛爾Fig 3 HPLC chromatograms of degradation testsA.samples treated with strong acid；B.samples treated with strong alkali；C.samples treated with oxidation；D.samples treated with heat；E.samples treated with strong light；1.labetalol hydrochloride

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限考察

取鹽酸拉貝洛爾對照品約10 mg，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液；分別精密量取該溶液0.4、1.0、1.6、2.0、2.4、3.0、3.6 ml，置于10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，分別取上述溶液10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度（c）對峰面積（y）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：y＝14445c+10585（r＝1.0000，n＝7）。由此可見，鹽酸拉貝洛爾檢測質(zhì)量濃度線性范圍為41.40～372.60 μg/ml。取鹽酸拉貝洛爾對照品溶液逐步稀釋測定，得檢測限為52.54 ng/ml（信噪比為6.0）。

2.5 回收率試驗

精密稱取鹽酸拉貝洛爾對照品適量，加入處方量的輔料溶液，用流動相溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含鹽酸拉貝洛爾160、200、240 μg的溶液各3份，精密量取10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取鹽酸拉貝洛爾對照品適量，同法測定，計算每份的回收率。結(jié)果，低、中、高3種不同水平溶液的回收率分別為100.1%、100.2%、99.6%，RSD分別為0.91%、0.19%、0.71%；平均回收率為99.97%，RSD為0.64%。

2.6 精密度試驗

取批號為100101的樣品，于同日內(nèi)及6 d內(nèi)各分別測定含量6次，計算日內(nèi)和日間RSD。結(jié)果，鹽酸拉貝洛爾的平均含量分別為100.9%和100.8%，日內(nèi)、日間RSD分別為0.56%和0.58%，表明本方法精密度良好。

2.7 相對響應(yīng)因子

游離羧酸是鹽酸拉貝洛爾注射液在貯藏過程中酰胺基可能水解生成的特殊雜質(zhì)，BP2011年版采用TLC外標(biāo)對照品法測定其含量。取鹽酸拉貝洛爾對照品和游離羧酸對照品各適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 ml中含鹽酸拉貝洛爾和游離羧酸各約25 μg和100 μg的混合溶液，進行相對響應(yīng)因子測定。結(jié)果，游離羧酸與鹽酸拉貝洛爾的相對響應(yīng)因子為1.05。為方便試驗，同時考慮到游離羧酸與鹽酸拉貝洛爾的相對響應(yīng)因子在0.90～1.10范圍內(nèi)，故以鹽酸拉貝洛爾為自身對照測定雜質(zhì)。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取批號為100101的供試品溶液，分別于0、1、3、6、12、24 h進行有關(guān)物質(zhì)測定，結(jié)果供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，詳見表1。

表1 溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab 1 Results of stability test of solution

2.9 有關(guān)物質(zhì)檢查方法

取本品，作為供試品溶液；精密量取1 ml，置于100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。精密量取對照溶液10 μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%，再精密量取供試品溶液和對照溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3.5倍。供試品溶液的色譜圖中如顯雜質(zhì)峰，單個雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液的主峰面積（1.0%），各雜質(zhì)峰面積之和不得大于對照溶液主峰面積的2倍（2.0%）。

2.10 樣品測定

取鹽酸拉貝洛爾注射液3批，按“2.1”及“2.9”項下方法制備供試品溶液及對照溶液，測定主藥含量和有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 測定有關(guān)物質(zhì)的必要性

表2 3批樣品含量和有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果（%%）Tab 2 Determination results of content and related substances in 3 batches of samples（%%）

鹽酸拉貝洛爾分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基和酰胺基，在生產(chǎn)和貯藏過程中可能被氧化和水解，亦可能產(chǎn)生降解物，而國家標(biāo)準(zhǔn)中未進行有關(guān)物質(zhì)檢查。BP2011年版[5]采用TLC法對鹽酸拉貝洛爾注射液的有關(guān)物質(zhì)進行了檢查，規(guī)定游離羧酸不得過2.0%，其他雜質(zhì)不得過0.5%。可見，有必要建立一個完善合理的檢查方法對鹽酸拉貝洛爾注射液的質(zhì)量進行控制和提高。

3.2 色譜條件的選擇

BP2011年版[5]中采用TLC法測定鹽酸拉貝洛爾注射液的有關(guān)物質(zhì)。與HPLC法比較，TLC法的靈敏度和分離度均較低，且不易定量檢測，標(biāo)準(zhǔn)中供試品溶液的濃度高達80 mg/ml，在實際試驗過程中易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，影響試驗結(jié)果。HPLC法具有分離效果好、靈敏度高的特點，能進行定量檢測，供試品溶液濃度較低，測定結(jié)果更加準(zhǔn)確。因而筆者參考USP34版[4]含量測定的色譜條件，建立了HPLC含量測定方法，同時也建立了分離度、靈敏度和準(zhǔn)確度均更好的HPLC檢查有關(guān)物質(zhì)的方法，取得了滿意的結(jié)果。

3.3 色譜條件的優(yōu)化

參考BP2011年版[5]鹽酸拉貝洛爾有關(guān)物質(zhì)測定和USP34版[4]鹽酸拉貝洛爾片含量測定的色譜條件，考慮到溶劑對試驗者身體健康和環(huán)境的影響，避免使用四氫呋喃，選用甲醇和磷酸鹽緩沖液為流動相。標(biāo)準(zhǔn)中的柱溫為60℃，為常規(guī)十八烷基硅烷鍵合硅膠柱的最高使用溫度，長時間使用，會影響色譜柱壽命，增加色譜柱損耗。故在試驗中，對色譜柱的柱溫和流動相中甲醇和磷酸鹽緩沖液的比例進行了考察。當(dāng)柱溫為60℃，甲醇與磷酸鹽緩沖液的比例為35∶65時，拉貝洛爾的出峰時間約為16.0 min，峰形較鈍，有分叉跡象，柱效很低；當(dāng)柱溫降為40℃時，保留時間延長至62.8 min，峰形分叉；試著提高甲醇比例至55%，降低柱溫至25℃，拉貝洛爾的保留時間約為11.5 min，峰形分叉；提高柱溫至50℃，拉貝洛爾的保留時間提前至約6.3 min，出峰時間合適，柱效較高，峰形尖銳對稱。經(jīng)鹽酸拉貝洛爾與游離羧酸的分離度試驗及鹽酸拉貝洛爾注射液的強制降解試驗，此色譜條件能使主峰與游離羧酸峰及各降解物峰均完全分離。

3.4 色譜行為的分析

在色譜條件的優(yōu)化試驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動相中甲醇占比較低或柱溫較低時，鹽酸拉貝洛爾保留時間延長，柱效大大降低，色譜峰變鈍或分叉。原因是鹽酸拉貝洛爾為一對非對映異構(gòu)體混合物[6-8]，在出峰較慢時因色譜行為略有差異，有一定程度的分離；當(dāng)流動相中甲醇占比或柱溫提高時，非對映異構(gòu)體色譜行為趨于一致，色譜峰尖銳對稱。當(dāng)柱溫為60℃時，較低的甲醇占比并不能使非對映異構(gòu)體的色譜行為完全一致，而高柱溫反而會加速色譜柱的損耗；相反，提高甲醇占比至55%，同時降低柱溫至50℃，非對映異構(gòu)體的色譜行為基本一致，同時能使十八烷基硅烷鍵合硅膠柱有較長的使用壽命。

3.5 檢測波長的選擇

取鹽酸拉貝洛爾對照品和游離羧酸對照品各適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 ml中含鹽酸拉貝洛爾和游離羧酸各約25 μg和100 μg的混合溶液，進行HPLC-紫外法測定，結(jié)果顯示鹽酸拉貝洛爾和游離羧酸均在230 nm波長處有較大吸收；同時降解試驗顯示，各降解雜質(zhì)均在230 nm波長處有較大吸收，因而選用230 nm波長測定有關(guān)物質(zhì)。

3.6 非對映異構(gòu)體的檢查

鹽酸拉貝洛爾為一對非對映異構(gòu)體，Carvalho TM[6]、Bragg W[7]和Goel TV[8]等采用液相色譜（LC）-質(zhì)譜（MS）/MS、毛細管電色譜（CEC）-MS和毛細管電泳法對鹽酸拉貝洛爾非對映異構(gòu)體的分離和測定進行了詳細的研究，BP2011年版[5]亦采用衍生化氣相色譜（GC）法對非對映異構(gòu)體的比例進行了控制。在擬提高的國家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，采用衍生化GC法對非對映異構(gòu)體的比例進行考察。本試驗中，鹽酸拉貝洛爾的一對非對映異構(gòu)體合并為單個色譜峰出峰，以單個色譜峰作為一種物質(zhì)進行分析。

3.7 含量測定方法的統(tǒng)一

為提高方法的準(zhǔn)確度與靈敏度，含量測定由紫外外標(biāo)對照品法修改為HPLC外標(biāo)對照品法，色譜條件同有關(guān)物質(zhì)測定方法。結(jié)果表明方法的線性、準(zhǔn)確度和精密度均良好。

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