RP-HPLC法測定注射用磷酸肌酸鈉有關物質的含量

郭興輝，王倩雯（1.河南省食品藥品檢驗所，鄭州450000；.中山大學藥學院，廣州516000）

磷酸肌酸鈉是一種心肌保護劑，臨床上用于治療橫紋肌活性不足，是心肌疾病的輔助治療藥物[1]。2010年版《中國藥典》二部未收載該原料藥及制劑，其質量標準收載于進口藥品質量標準中，且僅對其總雜質的量進行了控制，在其他文獻中未見有關磷酸肌酸鈉有關物質的報道。為更好地控制藥品質量，本文建立了反相（離子對）高效液相色譜（RP-HPLC）法測定注射用磷酸肌酸鈉中已知雜質肌酸、肌酸酐和磷酸肌酸酐的含量。經方法學考察，線性關系良好、專屬性好、回收率滿意，且操作快速、結果準確，同時對其他有關物質也進行了控制[2]。表明所建立的方法適用于該原料藥合成及制劑分裝前生產過程中的質量控制。

1 材料

2695 HPLC儀、2996二極管陣列檢測器（PDA）、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；AE-240電子分析天平（上海梅特勒-托利多公司）。

注射用磷酸肌酸鈉（由某公司提供，批號：20111211、20111221、20111231，規格：每瓶0.5 g）；肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐、磷酸肌酸鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：100876-200901、100877-200901、C1413、100875-200901，純度分別為：99.7%、99.2%、97.8%、76.2%）；四丁基磷酸氫銨為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Waters C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.005 mol/L四丁基磷酸氫銨溶液（取四丁基磷酸氫銨1.7 g，加水900 ml使溶解，用20%磷酸鈉調節pH值至7.0，用水稀釋至1000 ml），流速：1.0 ml/min；溶劑：水；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μl。理論板數按磷酸肌酸鈉峰計為7854。

2.2 空白試驗

注射用磷酸肌酸鈉由磷酸肌酸鈉原料藥無菌分裝制成，沒有輔料添加，因此，取有關物質測定時溶解樣品的溶劑10 μl，按上述色譜條件進樣測定。結果溶劑不干擾樣品中肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐和其他有關物質的測定，見圖1。

2.3 肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐線性關系考察

取肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐對照品適量，精密稱定，加水制成含肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐50、50、100 μg/ml的混合溶液，分別稀釋成不同質量濃度（肌酸、肌酸酐為10、25、50、75、100、125 μg/ml，磷酸肌酸酐為20、50、100、150、200、250 μg/ml）溶液注入色譜儀，記錄色譜圖。以質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標進行回歸，得回歸方程分別為：肌酸：y＝915.69x+5.6519（r＝0.9999，n＝5）；肌酸酐：y＝2664.5x－4.7182（r＝0.9999，n＝5）；磷酸肌酸酐：y＝1117.6x+4.8245（r＝0.9999，n＝5）。結果表明，肌酸、肌酸酐檢測質量濃度線性范圍為10～125 μg/ml；磷酸肌酸酐檢測質量濃度線性范圍為20～250 μg/ml。

2.4 檢測限和定量限

取“2.3”項下的混合溶液及磷酸肌酸鈉對照品溶液稀釋后進樣，當信噪比為3∶1時，肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐、磷酸肌酸鈉檢測限分別為0.5、0.25、2.0、0.5 ng；當信噪比為10∶1時，定量限分別為1.0、0.5、1.5、1.0 ng。

圖1 磷酸肌酸鈉專屬性試驗高效液相色譜圖A.溶劑；B.未經破壞樣品；C.酸破壞樣品；D.堿破壞樣品；E.高溫破壞樣品；F.氧化破壞樣品；G.光破壞樣品；1.磷酸肌酸鈉Fig 1 HPLC chromatograms of specificity test of creatine phosphate sodiumA.solvent；B.undestroyed samples；C.samples destroyed by acid；D.samples destroyed by alkali；E.samples destroyed by high temperature；F.samples destroyed by oxidation；G.samples destroyed by high light；1.creatine phosphate sodium

2.5 精密度和穩定性試驗

取“2.3”項下混合溶液，重復進樣6次，以峰面積計算RSD，結果分別為肌酸：0.33%，肌酸酐：0.17%，磷酸肌酸酐：0.61%，表明該方法精密度良好。取上述溶液，在2～8℃溫度條件下，分別于0、2、4、6、8、10 h進樣，測定肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐峰面積，結果RSD分別為0.60%、0.88%、1.32%，表明混合溶液在2～8℃溫度條件下10 h內基本穩定。

2.6 回收率試驗

取供試品（批號：20111211）約50 mg，共9份，精密稱定，分別加入肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐混合溶液（500、500、1000 μg/ml）0.8、1.0、1.2 ml各3份，置于10 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；取10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，外標法計算含量及回收率。結果，肌酸的平均回收率為100.9%，RSD＝1.3%；肌酸酐平均回收率為99.2%，RSD＝1.2%；磷酸肌酸酐平均回收率為99.8%，RSD＝0.8%。表明該方法準確度良好，基本滿足肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐的測定要求，詳見表1、表2、表3。

2.7 專屬性試驗

取供試品（批號：20111211）約50 mg，共6份，進行不同條件下的降解試驗，試驗條件分別為：（1）未經破壞；（2）酸破壞：加入0.1 mol/L的鹽酸溶液2 ml，室溫放置20 min后用堿中和；（3）堿破壞：加入0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液2 ml，室溫放置20 min后用酸中和；（4）高溫破壞：樣品在120℃烘箱中放置1 h；（5）氧化破壞：加入30%的雙氧水0.5 ml，室溫放置20 min；（6）光破壞：在1500 lx的強光下照射12 h。以上樣品均用水溶解制成5 mg/ml的溶液，搖勻，測定。結果，所有降解產物與主峰的分離度均符合要求，表明該方法的專屬性較強，色譜見圖1。

表1 肌酸回收率試驗結果（n＝9）Tab 1Results of recovery test of creatine（n＝9）

表2 肌酸酐回收率試驗結果（n＝9）Tab 2Results of recovery test of creatinine（n＝9）

表3 磷酸肌酸酐回收率試驗結果（n＝9）Tab 3Results of recovery test of creatinine phosphate（n＝9）

2.8 樣品中肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐及其他有關物質的含量測定

3種已知雜質采用對照品對照法計算含量，有關物質采用主成分自身對照法計算含量。取供試品適量，加水溶解并制成5000 μg/ml的溶液作為供試品溶液；將供試品溶液稀釋成50 μg/ml的溶液作為對照溶液；取肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐對照品適量，加水溶解制成50、50、100 μg/ml的溶液作為對照品混合溶液。進樣測定，記錄色譜圖至主峰保留時間的2倍。結果，供試品溶液和對照品混合溶液色譜見圖2，數據結果見表4。

3 討論

3.1 波長的選擇

圖2 有關物質測定高效液相色譜圖A.供試品溶液；B.對照品混合溶液；1.肌酸；2.肌酸酐；3.磷酸肌酸酐Fig 2 HPLC chromatograms of related substance testsA.test sample solution；B.mixed solution control；1.creatine；2.creatinine；3.creatinine phosphate

表4 3批樣品中有關物質含量測定結果（%%）Tab 4 Results of content determination of related substance in 3 batches of samples（%%）

采用本文選定的色譜條件，分別對流動相、溶劑、磷酸肌酸鈉對照品、肌酸對照品、肌酸酐對照品、磷酸肌酸酐鈉對照品采用PDA檢測。結果，肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐、磷酸肌酸鈉的最大吸收波長均為210 nm，因此選定210 nm為有關物質檢查的檢測波長。綜合HPLC-PDA檢測和專屬性試驗結果可以看出，磷酸肌酸鈉及其雜質在210 nm波長處均可以檢出，試驗溶液在各種破壞條件下有關物質均能有效檢出，主峰與雜質峰之間能夠良好地分離。因此，選擇210 nm作為有關物質檢測波長能有效檢出雜質，未漏檢雜質峰。

3.2 流動相的選擇

分別采用0.04、0.05、0.06 mol/L的四丁基磷酸氫銨溶液，并分別調pH為6.8、7.0、7.2，在25、30、35 ℃的柱溫條件下，對磷酸肌酸鈉進行測定。結果發現流動相濃度為0.05 mol/L、pH值為7.0、柱溫為30℃時，磷酸肌酸鈉峰的保留時間合適，峰形好，柱效高。同時對不同品牌的色譜柱進行比較，發現Waters C18柱較Diamonsil C18柱分離效果好、耐用性強。故選作本文的色譜條件進行分析。

3.3 溶液穩定性

試驗中發現，制備好的溶液在室溫放置時，隨著放置時間的延長，磷酸肌酸鈉峰面積隨之減小，有關物質的含量相應增加，對含量和有關物質測定結果影響較大。故建議制備好的溶液于2～8℃溫度條件下保存[3]，且宜臨用新配。

綜上，本文建立的方法靈敏度高、專屬性強，可用于注射用磷酸肌酸鈉中有關物質的質量控制。

[1]王汝衛.磷酸肌酸的藥理與臨床應用[J].首都醫藥，1999，6（5）：32.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：172-176.

[3]祁廣建，沈國英，王毅，等.離子對色譜法測定磷酸肌酸鈉的穩定性[J].中國醫院藥學雜志，2004，24（1）：11.