沙苑子總黃酮對博萊霉素致大鼠肺纖維化的干預作用及其機制研究

侯 燕，馮一中，蔣小崗，顧振綸，毛新妍

(1.蘇州大學醫學部，病理學與病理生理學系，江蘇 蘇 州 215123;2.蘇州大學中藥研究所，江蘇 蘇州 215007;3.蘇州大學附屬第二醫院病理科，江蘇 蘇州 215004)

肺纖維化(pulmonary fibrosis)是一種肺損傷后較為嚴重的并發癥，發病機制尚未明確［1］，其主要的病理改變為彌漫性肺泡炎癥、肺成纖維細胞灶的形成以及細胞外基質過度沉積［2－3］。近年來肺纖維化的發病率呈上升趨勢［4］，確診后平均生存時間為2～5年，60%的患者直接死于該病［5］，盡管國內外對于該病的研究已取得了很大進展，至今尚未發現治愈肺纖維化的藥物，因此，尋找新的有效的治療肺纖維化的藥物，成為國內外共同關注的問題。

沙苑子總黃酮(total flavonoids from astragalus complanatus，FAC)是中藥沙苑子(shayuanzi)的干燥成熟種子中提取的有效成分。沙苑子為豆科植物扁莖黃芪(Astragalus complanatusR.Br)的干燥成熟種子，具有補益肝腎的功效，主要含有黃酮類、三萜類、有機酸等［6］。研究證實FAC具有抗腫瘤、抗肝纖維化、抗衰老等作用［7］，但FAC對大鼠肺纖維化的治療作用鮮見報道。本文采用博萊霉素滴注法制作大鼠肺纖維化模型，初步探討沙苑子總黃酮對肺纖維化的干預作用及其作用機制。

1 材料

1.1 藥品與試劑 沙苑子總黃酮，總黃酮含量為67%，由蘇州中藥研究所植化室提供，批號2012102;醋酸潑尼松龍片，5 mg/片，江蘇徐州平光制藥有限責任公司提供;博萊霉素A5，白色凍干粉末，15 mg/支，日本化藥株式會社生產，批號640110;總抗氧化能力(T-AOC)、羥脯氨酸(HYP)測定試劑盒，由南京建成生物工程公司供應;大鼠白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)酶聯免疫分析試劑盒，購于R＆D公司。

1.2 動物 清潔級SD大鼠，♂，體質量(200±20)g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號:SCXK(滬)2009-005，飼養在清潔級動物觀察室，給藥期間自由飲水進食。

1.3 主要儀器 紫外可見分光光度計，T6新世紀型，儀器編號:18-1650-01-016，為北京普析通用儀器有限責任公司生產;H-1650臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;光學顯微鏡OLYMPUS CX31;高速低溫冷凍離心機，5417R型，德國艾本德股份公司生產;XHF-D高速分散器(內切式勻漿機)，寧波新芝生物科技股份有限公司生產;電子天平，PL203型，購于梅特勒公司。

2 方法

2.1 大鼠肺纖維化模型復制 腹腔注射4%的水合氯醛(0.1ml·kg－1)麻醉大鼠，固定頭部及四肢，使其仰臥于手術臺，常規消毒，沿頸部正中線做一切口，鈍性分離各層組織，暴露氣管，用1ml注射器刺入大鼠氣管軟骨環間隙，緩慢注入BLM A5(5 mg·kg－1，0.01 ml·kg－1)，正常對照組在相同條件下注入相應體積生理鹽水。注入藥后立即將大鼠直立，沿身體縱軸左右旋轉3～5 min，使藥液分布均勻，然后縫合皮膚、消毒，大鼠清醒后送觀察室飼養。術前1 d及術后3 d，所有大鼠每天肌肉注射80萬U青霉素鈉(1 ml/只)。

2.2 動物分組和給藥 SD大鼠78只，隨機分為6組，稱重、編號，即正常對照組、模型組、陽性藥醋酸潑尼松組(3.34 mg·kg－1)、沙苑子總黃酮大劑量組(140 mg·kg－1，FAC-L)、中劑量組(70 mg·kg－1，FAC-M)、小劑量組(35 mg·kg－1，FAC-S)，每組大鼠13只。各組大鼠造模后，d 2開始每隔1 d稱重1次，按照相應的體重灌服給藥，正常對照組及模型組給予相應體積生理鹽水，陽性對照組灌服潑尼松(3.34 mg·kg－1)，各治療組分別給予不同劑量的FAC，連續給藥28 d。

2.3 檢測指標 每組隨機取8只進行血清及肺組織勻漿中總抗氧化能力(T-AOC)，肺組織勻漿中羥脯氨酸(HYP)含量的檢測，取剩余5只進行肺泡灌洗，檢測肺泡灌洗液中IL-1β及IL-6的含量，各指標檢測按照試劑盒說明書操作。

2.4 組織病理學觀察 取右肺下葉，用4%甲醛溶液固定，按病理學方法脫水、包埋、切片，進行HE和Masson染色，光鏡下觀察肺泡炎、肺纖維化程度，參照Szapiel［8］的方法觀察肺泡炎程度并分級計分，采用Hubner等［9］的方法觀察肺纖維化程度并進行評分。

2.5 組織超微結構的觀察 大鼠肺組織經4%戊二醛，1%鋨酸固定，梯度丙酮脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片機切片，透射電鏡觀察。

2.6 沙苑子總黃酮對肺纖維化大鼠TGF-β/Smad信號通路相關蛋白表達的檢測 提取組織蛋白，測定其濃度，各組加入60 μg蛋白樣本，加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min后，按照分子量大小配制相應濃度的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳、轉膜、封閉，加入一抗4℃結合過夜，加入二抗充分結合，用化學發光法進行顯色反應。

2.7 統計學分析 實驗數據采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差與秩和檢驗分析，實驗結果采用±s表示。

3 結果

3.1 FAC對大鼠肺纖維化的干預作用 與對照組相比，模型組大鼠肺組織勻漿中HYP的含量明顯上升(P＜0.01);與模型組相比，陽性藥醋酸潑尼松組和FAC各給藥組的肺組織勻漿中HYP含量明顯下降(P＜0.01)，見 Tab 1。

Masson染色結果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠肺泡結構嚴重破壞，肺泡間隔明顯增寬，間隔內見大量膠原沉積，提示纖維化形成;陽性對照組及FAC各給藥組鏡下觀察肺纖維化程度均有不同程度的減輕，參照Hubner等［9］的方法觀察肺纖維化程度并評分，見 Tab 2，Fig 1。

Tab 1 Effect of FAC on levels of HYP in lung tissue of pulmonary fibrosis rats(±s，n=8)

Tab 1 Effect of FAC on levels of HYP in lung tissue of pulmonary fibrosis rats(±s，n=8)

##P＜0.01 vs control;＊＊P＜0.01 vs model

Group Dose/mg·kg－1 HYP/μg·g －1 Control － 0.98 ±0.07 Model － 1.40 ±0.16##FAC 140 1.19 ±0.15＊＊70 1.22 ±0.14＊＊35 1.24 ±0.11＊＊Prednisolone 3.34 1.20 ±0.14＊＊

Tab 2 Effect of FAC on alveolitis and fibrosis extent of pulmonary fibrosis rats(±s，n=8)

Tab 2 Effect of FAC on alveolitis and fibrosis extent of pulmonary fibrosis rats(±s，n=8)

##P＜0.01 vs control;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model

Group Dose/mg·kg－1Score of alveolitis Score of fibrosis Control － 0.62 ±0.51 1.28 ±0.48 Model － 2.50 ±0.50## 6.20 ±0.65##FAC 140 1.50 ±0.53＊＊ 3.03 ±0.58＊＊70 1.62 ±0.74＊＊ 3.45 ±0.76＊＊35 2.00 ±0.53* 4.45 ±0.54＊＊Prednisolone 3.34 1.75 ±0.70* 3.28 ±0.63＊＊

3.2 FAC對肺纖維化大鼠超微結構的影響 電鏡觀察結果顯示:正常對照組肺組織結構完整清晰，未見明顯改變;模型組Ⅰ型肺泡上皮細胞變性，細胞崩解脫落，Ⅱ型肺泡上皮細胞增生，細胞內板層小體明顯減少，胞腔內空泡樣變，細胞線粒體明顯腫脹，見較多膠原纖維沉積。與模型組相比，潑尼松組及FAC各給藥組大鼠肺組織情況明顯改善，肺泡間隔纖維沉積減少，Ⅱ型肺泡上皮細胞數量減少，細胞內板層小體數量增多，表面微絨毛較豐富，線粒體腫脹減輕。見Fig 2。

Fig 1 Pathological observation of lung tissue in rats by Masson staining(Masson×100)

3.3 FAC對肺纖維化大鼠肺組織炎癥程度的影響

與對照組相比，模型組大鼠血清中T-AOC的水平明顯降低(P＜0.01)，與模型組比較，潑尼松組與FAC各給藥組大鼠血清中T-AOC的能力明顯加強(P＜0.01或者P＜0.05)，見Tab 3。

與對照組相比，模型組大鼠肺組織勻漿中TAOC的含量明顯下降(P＜0.01)，與模型組相比，潑尼松組與FAC各給藥組的肺組織勻漿中的T-AOC能力明顯加強(P＜0.01或者P＜0.05)，見Tab 3。

與對照組相比，模型組肺泡灌洗液中IL-1β及IL-6的含量明顯升高(P＜0.01);與模型組相比，潑尼松及FAC各給藥組肺泡灌洗液中IL-1β及IL-6的含量明顯減少(P＜0.01或者P＜0.05)，見Tab 4。

HE染色顯示:正常對照組大鼠，肺組織結構完整清晰，肺泡間隔未見增厚，肺泡腔未見明顯改變;模型組大鼠:肺泡結構嚴重破壞，肺泡間隔明顯增寬，大量炎性細胞浸潤及成纖維細胞增生，陽性對照組及FAC各給藥組鏡下觀察炎癥均有不同程度的好轉，參照Szapiel等［8］的方法對肺泡炎程度進行評分，結果見 Tab 2，Fig 3。

Fig 2 Electron microscope studies of lung tissue in pulmonary fibrosis rats

Fig 3 Pathological observation of lung tissue in rats by HE staining (HE×100)

Tab 3 Effect of FAC on levels of T-AOC of pulmonary fibrosis rats in serum and the lung tissue(±s，n=8)

Tab 3 Effect of FAC on levels of T-AOC of pulmonary fibrosis rats in serum and the lung tissue(±s，n=8)

##P＜0.01 vs control;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model

Group Dose/mg·kg－1 T-AOC/kU·L－1 in serum T-AOC/kU·L－1 in the tissue Control － 10.61 ±2.66 14.71 ±3.23 Model － 6.67 ±2.10## 9.52 ±1.64##FAC 140 9.47 ±1.49＊＊ 12.56 ±1.68＊＊70 8.95 ±1.04* 11.72 ±1.54＊＊35 8.76 ±1.14* 11.63 ±2.17*Prednisolone 3.34 9.54 ±2.60* 12.78 ±3.86*

Tab 4 Effect of FAC on levels of IL-1β，IL-6 in bronchoalveolar lavage fluid of pulmonary fibrosis rats(±s，n=5)

Tab 4 Effect of FAC on levels of IL-1β，IL-6 in bronchoalveolar lavage fluid of pulmonary fibrosis rats(±s，n=5)

##P ＜0.01 vs control;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

Group Dose/mg·kg－1IL-1β/ng·L－1 IL-6/ng·L －1 Control － 6.64 ±0.93 15.78 ±1.13 Model － 8.56 ±0.97## 18.10 ±1.35##FAC 140 7.03 ±1.29＊＊ 15.09 ±1.72＊＊70 7.20 ±0.98* 15.73 ±2.50*35 7.21 ±1.59* 16.41 ±1.29*Prednisolone 3.34 7.11 ±0.73＊＊ 16.16 ±1.21*

3.4 FAC對肺纖維化大鼠肺組織中相關蛋白 α-SMA、TGF-β、Smad2表達的影響 與正常對照組相比，模型組肺組織中蛋白 α-SMA、TGF-β、Smad2的含量均明顯升高;與模型組相比，各給藥組中的α-SMA、TGF-β、Smad2 的含量明顯降低，見 Fig 4、5。

Fig 4 Expression of α-SMA，Smad2，TGF-β of lung tissue in pulmonary fibrosis rats

Fig 5 Analysis of the relative density value of α-SMA，Smad2，TGF-β in BLM-induced pulmonary fibrosis rats

4 討論

博萊霉素(BLM)是一種細胞毒性抗癌藥物，具有致肺纖維化的副作用［10］，以BLM復制肺纖維化動物模型被認為是最近似于特發性肺纖維化病理改變的模型［11］。

羥脯氨酸(HYP)在膠原組織中占13.4%，彈性蛋白中含量極少，其他蛋白中均不存在，因此檢測肺組織HYP含量常用來反映膠原沉積情況。本實驗結果顯示，模型組大鼠組織勻漿及血清中HYP的含量與對照組相比明顯增多;肺組織病理學觀察表明模型組大鼠肺組織中肺纖維化程度明顯加重;綜上提示本實驗肺纖維化模型復制成功。本文實驗條件下，FAC各給藥組，組織中HYP含量明顯減少，組織病理學觀察及超微結構顯示FAC給藥組大鼠肺組織的肺纖維化程度明顯減輕，提示FAC有明顯的抗肺纖維化作用。

文獻報道，氧化抗氧化失衡引起的氧化應激反應是肺纖維化發病重要機制之一，糾正體內氧化抗氧化失衡可減輕肺纖維化的程度。在本文實驗中，FAC給藥組中血清及組織勻漿中T-AOC的含量與模型組相比明顯升高，提示FAC可以提高組織抗氧化的能力。IL-1β及IL-6是炎癥因子，均具有致纖維化作用［12－13］，在本文實驗中，各給藥組肺泡灌洗液中這兩種細胞因子的含量明顯降低，提示FAC有減輕炎癥反應的作用;同時組織病理學HE染色結果也顯示FAC有減輕肺泡炎癥的作用。

細胞因子的相互作用是肺纖維化發病機制的另一重要因素，TGF-β是目前公認的致纖維化因子，其作用途徑TGF-β/Smad信號通路在肺纖維化發生發展中起了重要的作用［14］。機體受到外界刺激時，TGF-β 活化，然后與 TGF-β 受體Ⅱ結合，TGF-β 受體Ⅱ自身磷酸化，進而引起TGF-β受體Ⅰ胞內近膜區的GS結構域磷酸化而具有激酶活性，被激活的TGF-β受體可使下游的Smads蛋白(Smad2/3)磷酸化，后者可與介質Smad4蛋白結合形成三聚體轉位到核內，產生一系列的細胞綜合應答［15］。表現為肺成纖維細胞(Fb)的增殖、平滑肌肌動蛋白-α(α-SMA)的表達增加，從而使成纖維細胞(Fb)轉化為肌成纖維細胞(MFb)，還可使細胞外基質在肺間質及肺泡間過度沉積，最終導致肺纖維化的發生與發展［14］。α-SMA作為 MFb的標志性蛋白，其含量表達水平可以間接反映MFb的增值情況，也可間接反映肺纖維化的程度［16］。本文 Western blot結果顯示，模型組大鼠肺組織 α-SMA、TGF-β、Smad2的含量明顯增加，FAC各給藥組大鼠肺組織中的 α-SMA、TGF-β、Smad2的含量均明顯降低，提示博萊霉素可能激活了TGF-β/Smad信號通路，使肺組織中α-SMA、TGF-β、Smad2的含量明顯上升，而 FAC 有可能抑制了TGF-β/Smad信號通路，使肌成纖維細胞的生成減少，從而導致大鼠的肺纖維化程度降低。

綜上所述，在本文實驗條件下，FAC對BLM致大鼠肺纖維化有一定的治療作用，其機制可能與其抗氧化作用、抑制炎癥細胞浸潤活化、減少膠原生成及調控TGF-β/Smad信號通路有關。

［1］Kikuchi N，Ishii Y，Morishima Y，et al.Aggravation of bleomycin－induced pulmonary inflammation and fibrosis in mice lacking peroxiredoxin I［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2011，45(3):600－9.

［2］Wahers D M，Cho H Y，Kleeberger S R.Oxidative stress and antioxidants in the pathogenesis of pulmonary fibrosis:a potential role for Nrf2［J］.Antioxid Redox Signal，2008，10(2):321－32.

［3］Xu M，Deng B，Chow Y L，et al.Effects of curcumin in treatment of experimental puhnonary fibrosis:A comparison with hydrocortisone［J］.J Ethnopharmacol，2007，112(2):292－9.

［4］Wang Z L.Advances in understanding of idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Chin Med J，2009，122(7):844－57.

［5］Antoniou K M，Alexandrakis M G，Siafakas N M，Bouros D.Cytokine network in pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Sareoidosis Vase Diffuse Lung Dis，2005，22(2):91－5.

［6］劉春宇，顧振綸，張克平，等.沙苑子黃酮對DMN誘導的大鼠肝纖維化形成的影響［J］.中國藥理學通報，2004，20(1):110－3.

［6］Liu C Y，Gu Z L，Zhang K P，et al.Effect of flavonoids of astragali complanali on liver librosis induced by DMN in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(1):110－3.

［7］劉春宇，顧振綸，韓 蓉，等.沙苑子提取物對小鼠四氯化碳肝損傷的保護作用［J］.中草藥，2002，33(12):1104－6.

［7］Liu C Y，Gu Z L，Han R，et al.Protective effect of extract in seed of Astragalus complanatus on acute hepatic injury induced by carbon tetrachloride in mice［J］.Chin Trad Herbal Drugs，2002，33(12):1104－6.

［8］Szapiel S V，Elson N A，Fulmer J D，et al.Bleomycin induced interstitial pulmona ry disease in the nude，athymic mouse［J］.AmRev Respir Dis，1979，120:893－9.

［9］Hubner R H，Gitter W，Mokhtari N E，et al.Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples［J］.Biotechniques，2008，44(4):507－17.

［10］Moeller A，Rodriguez-Lecompte J C，Wang L Q，et al.Models of pulmonary fibrosis［J］.Drug Discover Today:Disease Models，2006，3(3):243－9.

［11］Jack G，Geofrey J.Pulmonary fibrosis searching for model alswers［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2005，33:9－13.

［12］Agostini C，Gurrier C.Chemikine/cytokine cockail in idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Proc Am Thorac Soc，2006，3:357－63.

［13］Wynn T A.Cellular and molecular mechanisms of fibrosis［J］.J Pathol，2008，214:199－210.

［14］Usuki J，Matsuda K，Azuma A，et al.Sequential analysis of myofibroblast differentiation and transforming growth factor-betal/Smad pathway activation in murine pulmonary fibrosis［J］.J Nihon Med Sch，2012，79(1):46－59.

［15］Huang T，David L，Mendoza V，et al.TGF-β signalling is mediated by two autonomously functioning TβRI:TβRII pairs［J］.EMBO J，2011，30(7):1263－76.

［16］馬榮林，王尉平，蔣小剛，等.黃芩總黃酮對博萊霉素致大鼠肺纖維化的干預作用［J］.中國藥理學通報，2011，27(4):537－42.

［16］Ma R L，Wang W P，Jiang X G，et al.Effects of total flavonoids of scutellaria baicalensis georgi(TFSB)on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(4):537－42.