Survivin小分子抑制劑的計算機虛擬篩選及初步活性研究

張孝云，紀 慶，代曉華，2，姜琳琳，熊冬生，周 圓

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院，血液病醫院(血液學研究所)，實驗血液學國家重點實驗室，天津 300020;2.天津市口腔醫院暨南開大學附屬口腔醫院實驗研究中心，天津 300041)

Survivin是一種腫瘤特異性凋亡抑制因子，是凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis，IAP)家族的成員。與其它IAP成員不同，survivin選擇性表達于大多數腫瘤組織，但并不在成人正常組織中廣泛分布。Survivin的異常增高與許多腫瘤的發生、發展及不良預后密切相關，因此被認為是特異性靶向腫瘤治療的理想靶點［1－2］。

目前靶向survivin的抑制劑主要集中在反義核酸，核酶，siRNA 序列等［3－5］，而小分子抑制劑還少見報道。Sun等［6］報道了survivin蛋白與其抑制性配體Smac/Diablo復合物的三維結構，為survivin小分子抑制劑的發現提供了結構基礎。本研究即基于此配體－受體復合物的晶體結構，利用計算機高通量篩選與化學信息學相結合的手段，尋找靶向survivin的小分子先導化合物，并對候選化合物的生物活性進行了初步研究。

1 材料和方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞株MCF-7、人白血病細胞株K562及其阿霉素耐藥細胞株K562/A02由本室長期保存。RPMI 1640培養基干粉為Invitrogen公司產品;胎牛血清購自中國醫學科學院血液學研究所科技公司。FITC Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒購自BD pharmingen，碘化丙啶(PI)購自sigma公司。活性氧檢測試劑盒由碧云天公司生產。DOCK4.0程序由美國加利福尼亞大學舊金山分校Kuntz實驗室提供，計算機篩選后進行生物活性檢測的化合物購自Specs公司。

1.2 三維結構數據庫的構建及受體結構數據的準備 在 Unix和 Linux系統下，利用 Tripos公司SYBYL6.7軟件包中的spl編程語言結合其它自行研究的輔助程序，將收集來的Specs化合物二維數據庫文件自動轉換為三維mol2格式的文件，其中包括加氫、加電荷和500步POWELL力場能量優化過程。從PDB晶體結構數據庫中下載survivin蛋白BIR3區與配體 Smac/Diablo復合物的三維結構數據文件(1XOX.pdb)，將其中的水分子及配體等雜原子除去，將所有的組氨酸His改為Hid，對生成二硫鍵的半胱氨酸Cys改為Cyx，經InsightⅡ模擬及歸屬力場后，作為DOCK計算的初始結構［7］。

1.3 負像的生成、對接及評分 根據配體－受體復合物的三維結構數據，利用SYBYL軟件包給蛋白加氫和加電荷，使用DMS程序計算受體的溶劑可接觸表面［8］，用SPHGEN模塊通過填充不同大小剛性小球的方法來描述與配體－受體結合腔穴的結構互補的立體特征，生成活性位點的負像。編寫dock.in文件確定各個參數文件位置，包括受體結構數據文件，活性位點負像數據文件，評分網格數據文件和配體結構數據文件及DOCK篩選時所需參數，然后在Linux下運行DOCK模擬和篩選。用錨點搜索方法搜索數據庫中配體可能的最好構象，根據能量打分的結果將數據排列起來。

1.4 初步生物學活性篩選 采用MTT法測定候選化合物對survivin高表達腫瘤細胞系的作用［9］。取對數生長期的細胞，每孔18，000個接種于96孔培養板，37℃，5%CO2培養箱中培養過夜后加入20 μl相應濃度的化合物，每個濃度設3個平行孔，對照組加入等體積的生理鹽水。培養68 h后加MTT(每孔20 μl，工作濃度為5 g· L－1)，繼續培養4 小時后，2 000 r·min－1離心10分鐘，棄上清后每孔加入100 μl DMSO，振蕩至沉淀完全溶解，酶標儀570 nm測定吸光度。按以下公式計算細胞生長抑制率。

1.5 Annexin V-FITC/PI染色檢測化合物對細胞凋亡的誘導作用 取對數生長期的細胞，每孔5×105個接種到6孔板中過夜培養。各孔分別加入不同濃度的化合物作用一定時間，處理結束后，1 000r·min－1離心10 min收集細胞，預冷PBS洗1次，用臺盼藍染色計數。取3×105細胞，1 000 r·min－1離心 10 min，棄上清，加 100 μl凋亡緩沖液，5 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI，輕輕混勻，避光孵育 15 min，然后加入400 μl凋亡緩沖液，混勻，立即在流式細胞儀上進行檢測［10］。

1.6 流式細胞儀檢測細胞中活性氧變化 取對數生長期細胞，每孔1×106個接種于6孔板過夜培養，70%～80% 融合貼壁后加入化合物進行處理。處理組中加化合物作用不同的時間或不同劑量，同時設置不加化合物處理的對照組。用終濃度為10 μmol·L－1的 DCFH-DA染料室溫避光孵育20 min，然后用無血清培養液洗3次，最后用1 ml PBS將細胞重懸，流式細胞儀檢測細胞內熒光強度［11］。

1.7 流式細胞儀檢測細胞周期變化 取對數生長期細胞，每孔2×105個接種于6孔板中，置于37℃孵箱內培養過夜，70%融合貼壁后，用不同濃度的化合物進行處理一定時間后收集細胞，5 ml PBS洗1次，1 200 r·min－1離心 5 min，棄上清，加入 70% 預冷甲醇固定，加入甲醇的同時渦旋混勻。冰上放置10 min，PBS 洗兩次，加入 150 μl 200 μg· L－1RNaseA，4℃孵育 15 min，加入 900 μl 50 mg·L－1PI，4℃孵育過夜，次日流式細胞儀檢測細胞周期變化，Flowjo軟件進行分析。

1.8 受體與化合物作用模式的分子圖像學分析選擇活性較好的先導化合物，將含有其對接后的mol2文件取出，與去掉配體的受體文件同時用SYBYL軟件包打開，觀察其理論上與受體結合的最佳作用方式(藥效構象)，分析化合物與受體之間的作用模式。

2 結果

2.1 計算機虛擬篩選結果 采用SPHGEN模塊在配體－受體結合部位填充大小不同的剛性小球，生成活性位點的負像。然后通過刪除重疊和分布不合理的圓球對負像進行修改，余下圓球堆積成的負像作為活性區域特征的代表。將含有149，214個小分子的Specs三維結構數據庫與活性區域進行對接，從中挑選兩萬個與受體結合腔穴匹配最好的分子，進一步選用多種具有代表性的打分函數進行二次篩選。其中1000個高得分化合物的能量值在－82.18～－35.34 Kcal/mol范圍。我們將這1000個化合物通過結構骨架進行分類，并結合類藥性原則，從中挑選并購買了有代表性的35個化合物進行生物學測試。這35個化合物的平均分子量為450.5(279.27～658.582)，其中分子量小于500的化合物占77%;氫鍵受體的平均值為5.8(2～11)，其中氫鍵受體少于9的化合物占94%;氫鍵供體的平均值為2(0～3);可旋轉鍵的平均值為8(3～14)，其中75%的化合物可旋轉鍵的數目在3～9之間;ClogP的平均值為3.7(－0.96～6.21)，其中Clog P小于5.5的化合物占94%。

2.2 初步生物學活性測定 根據計算機篩選的結果，首先以survivin高表達的人乳腺癌細胞MCF-7為模型，對購買到的35個化合物進行了初步生物學活性測定。結果表明35個化合物中有1-1、1-5、1-10、1-15、1-19、1-20、1-24、1-26、1-34 這九個化合物有明顯的抑制活性(IC50＜100 μmol·L－1)，其中 1-10、1-19、1-24 為代表的三類化合物 IC50在 30 μmol·L－1以下，以 1-19 最高(10.9 μmol·L－1)(Fig 1)。1-10、1-19、1-24的能量打分比較集中，范圍在－45.74～－43.07 Kcal/mol，類藥性分析顯示這3個化合物氫鍵供體數目為1～3，氫鍵受體數目為5～8，Clog P范圍為4.79～5.38。此外，我們還觀察了此3類化合物對survivin高表達的人白血病細胞K562及其耐藥細胞株K562/A02的生長抑制作用，結果表明，這3類化合物對K562及其耐藥細胞株也都具有明顯的抑制作用。而且與常規化療藥物阿霉素不同，survivin的小分子抑制劑對耐藥細胞K562/A02也有較好的抑制作用(Fig 2)。

Fig 1 Screening and structure of leading compounds

Fig 2 Growth inhibition of compounds 1-10，1-19 and 1-24 on K562 and K562/A02 cells

2.3 細胞凋亡誘導 MCF-7細胞用不同濃度的1-19化合物處理，24 h后收集細胞，用 Annexin VFITC和PI染色，流式細胞儀進行細胞凋亡測定。綜合分析3次以上獨立實驗的結果表明，3.5 μmol·L－1和7 μmol·L－1的 1-19 處理 24 h 后細胞早期凋亡比例分別為5.12% 和9.45%，但是不同劑量處理后細胞晚期凋亡比例沒有明顯差異，說明化合物1-19能夠呈劑量依賴性誘導MCF-7細胞早期凋亡(Fig 3)。

Fig 3 Apoptosis induced by compound 1-19 in MCF-7 cells

2.4 化合物誘導細胞發生S及G2/M期阻滯MCF-7細胞經過1-19處理12 h后，可以觀察到G0/G1期細胞所占分數下降，而S和G2/M期所占分數增加。與未處理組相比，7 μmol·L－1的1-19誘導 S期增加20%，G2/M期增加31.5%。在survivin高表達的K562及其耐藥細胞系K562/A02中，1-19同樣能夠誘導S期和G2/M期阻滯的發生。與未處理組相比，7 μmol·L－1的1-19處理12 h能夠使K562細胞 S期分數增加9.2%，G2/M期分數增加21.8%，K562/A02細胞S期分數增加10.4%，G2/M期分數增加47.5%(Fig 4)。

Fig 4 Effects of cell cycle arrest induced by compound 1-19

2.5 化合物誘導細胞活性氧水平升高 本研究利用熒光探針DCFH-DA進行活性氧檢測。DCFH-DA進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成不易通透細胞膜的DCFH，從而被裝載到細胞內，被細胞內的活性氧氧化生成有熒光的DCF。MCF-7細胞經 3.5 μmol·L－1及 7 μmol·L－11-19 作用處理 30分鐘后，隨化合物濃度增加細胞內的活性氧含量持續遞增(Fig 5)，分別升高至對照組的2倍和3.3倍。

Fig 5 Effects of ROS production induced by compound 1-19

2.6 分子圖像學分析 通過分子圖像學方法，我們進一步對化合物1-10、1-19及1-24與受體的相互作用模式進行了分析。通過分析survivin蛋白的三維結構，我們發現在BIR受體結合區5埃范圍內的氨基酸殘基為 THR48、LEU54、ALA55、GLN56、LYS62、GLU63、LEU64、GLU65、GLY66、TRP67、GLU68、ASP71、GLU76和 HIS80。如 Fig 6所示，化合物1-10、1-19和1-24都能夠很好的與survivin蛋白的受體結合腔穴結合，其中化合物1-10和1-24能夠與LYS62形成氫鍵，而1-19與1-10和1-24不同，它能夠通過與Asp71形成兩個穩定的氫鍵而抑制survivin的作用。

Fig 6 Molecular graphic analysis of the compounds and survivin

3 討論

本研究基于survivin靶點蛋白與配體的結合位點，對化合物三維結構數據庫進行搜索，利用分子對接技術將受體的結合腔穴與小分子三維結構進行匹配，并對這種對接的好壞進行能量打分。為了提高打分的精度和速度，我們對最初DOCK篩選得分高的前20000個化合物采用具有代表性的打分函數重新進行二次篩選，然后選擇前1000個化合物根據其骨架結構和類藥性進行分組。由于本研究的目的是選擇有潛在活性的先導化合物，為了不丟掉有活性的骨架結構，我們在化合物類藥性的原則上適度放寬，但是仍然保證大于70%的候選化合物滿足Lipinski的類藥性五原則。本研究挑選了35個化合物進行生物學活性測試，初步生物學活性結果顯示其中有9個化合物有明顯的抑制活性(IC50＜100 μmol·L－1)，其中3 個化合物 IC50在30 μmol·L－1以下。此外，這3個化合物對survivin高表達的人白血病細胞K562及其阿霉素耐藥細胞株K562/A02都具有明顯的抑制作用。這一結果也表明，與傳統化療藥物相比，開發survivin抑制劑能夠在一定程度上克服腫瘤的多藥耐藥。

細胞凋亡是在一定生理或病理條件下細胞發生的主動的程序性死亡過程。本研究篩選得到的先導化合物1-19能夠在較小劑量下誘導survivin高表達的MCF-7細胞中磷脂酰絲氨酸外翻，發生早期凋亡。有研究表明，survivin能夠通過抑制線粒體產生活性氧(ROS)來阻止細胞凋亡的發生，實驗中我們發現，針對survivin的小分子抑制劑1-19能夠在較低劑量下在30分鐘內促進MCF-7細胞內活性氧含量的增加。這也提示著應用survivin抑制劑可能能夠通過增加細胞內活性氧水平，在聯合化療增敏中發揮重要作用。

Survivin一個具有抑制細胞凋亡和調節細胞分裂的雙重功能的蛋白［12］，它主要表達于G2/M期。在腫瘤細胞中，這種周期依賴性表達以及其抗凋亡作用將有利于細胞逃離G2/M檢查點而發生凋亡耐受和持續增殖。本研究的結果顯示小分子化合物1-19能夠在多種survivin高表達的細胞中誘導S期和G2/M期阻滯的發生，而且在各種細胞中，G2/M阻滯增加的比例都要高于S期阻滯增加的比例。

受體與小分子化合物之間的作用是在三維空間進行的。由于單鍵的旋轉，二者結合時小分子化合物會發生構象的改變，稱為“藥效構象”。通過分子對接進行圖像學分析揭示小分子與受體之間的結合特征，可以從理論上探討小分子化合物的生物活性的本質。62位LYS是survivin蛋白翻譯后修飾的重要氨基酸殘基，分子作用模式分析發現化合物1-10和1-24能夠與LYS62形成氫鍵，提示了化合物具有活性的內在機制。化合物1-19是活性最高的化合物，其作用模式與1-10和1-24不同，它能夠與71位天門冬氨酸(Asp71)形成兩個穩定的氫鍵，Asp71是survivin配體結合區的關鍵氨基酸殘基，其單個氨基酸的改變就可以使survivin的凋亡抑制活性轉變為促凋亡活性。化合物1-19能夠與Asp71形成兩個穩定的氫鍵也可能其表現出高活性的重要分子基礎。

綜上所述，本研究基于survivin與其抑制性配體結合區的三維結構，用分子對接的方法對小分子化合物的三維結構數據庫進行能量打分和篩選。通過進一步生物學實驗和分子圖像學分析，初步確定了一個靶向survivin的先導化合物，為survivin小分子抑制劑的發現奠定了基礎。

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