三七皂苷R1對LPS誘導的小鼠心肌損傷的保護作用

吳 穎，孫 冰，肖 靜，孫桂波，呂圭源，李 明，陳素紅，孫曉波

(1.溫州醫(yī)學院藥學院浙江溫州 325035;2.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所北京 100193;3.浙江中醫(yī)藥大學中藥研究所浙江杭州 310053)

由內毒素引起的炎癥性疾病是由局部病原菌感染，而最終導致機體發(fā)生全身系統(tǒng)性反應。可引起心肌收縮力減弱，心肌受損，嚴重影響心臟功能。內毒素可激活單核巨噬細胞系統(tǒng)，釋放出腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素(IL-1β)等許多細胞因子和炎癥介質，導致細胞、組織、器官的損傷［1］。

中藥三七是我國的傳統(tǒng)珍貴藥材，具有止血、散瘀、消腫、止痛等功效，其以三七或總皂苷制成的制劑在臨床上廣泛用于心、腦血管疾病的治療［2］。三七皂苷R1屬于原人參三醇型，是三七中最具有代表的特征性化合物，具有廣泛的藥理作用，已作為冠心丹參滴丸的主要成分用于治療心肌缺血性疾病［3］。抗炎是三七皂苷R1的重要藥理作用之一，以往研究已證實三七皂苷R1對防治血管內皮細胞損傷有較好療效［4-5］，但關于 R1保護心肌損傷的藥理機制研究較少。本研究采用內毒素脂多糖LPS(lipopolysaccharide，LPS)誘導小鼠心肌損傷，建立急性內毒素心肌損傷模型［6］。現(xiàn)已證實，LPS能刺激NF-κB的活化，進而啟動VCAM-1和 ICAM-1的表達而參與心肌損傷的發(fā)生。本實驗通過檢測相關炎癥因子表達水平及在心肌組織中的浸潤情況，從而闡明中藥三七有效防治心肌損傷的藥理基礎和物質基礎，為三七有效防治心肌損傷疾病提供重要的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 C57BL/6J小鼠，♂，8～12周齡，質量(23±2)g，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所動物中心提供。隨機分為6組，每組5～8只:正常對照組(CTRL組)、模型組(LPS組)、預處理低劑量組(L+R1低組)、預處理中劑量組(L+R1中組)、預處理高劑量組(L+R1高組)和陽性藥組(3-去氮腺苷，3-deazaadenosine，c3Ado組)或單給藥組(R1組)。分別預防性給與三七皂苷R1(5、12.5或25 mg·kg-1;ip)3 日后，注射 LPS(10 mg·kg-1，ip)，作用8 h。

1.2 藥品與試劑 三七皂苷R1，購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司;3-去氮腺苷、LPS，均購自Sigma公司;ED-1、CD-11b抗體，均購自 Abcam公司;IκBα、NF-κB 抗體，均購自 Santa Cruz 公司;ELISA試劑盒，購自達科為公司和逸峰生物公司。其他試劑均為國產分析純，水為去離子水。

2 方法

2.1 超聲心動 C57BL/6J小鼠30只，每組5只，共6組。正常對照組腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)處理4 d。LPS組腹腔注射生理鹽水，連續(xù)處理3 d后注射LPS(10 mg·kg-1，ip)，作用8 h，建立內毒素心肌損傷模型。預處理組分別預防性給予三七皂苷 R1(5、12.5 或25 mg·kg-1，ip)，連續(xù)處理3 d 后注射LPS(10 mg·kg-1，ip)，作用8 h。陽性藥組預防性給予c3Ado(10 mg·kg-1，ip)，連續(xù)處理3 d后注射 LPS(10 mg·kg-1，ip)，作用 8 h。用 50 mg·kg-1的三溴乙醇進行麻醉，備皮，超聲心動測射血分數(shù)(EF)、縮短分數(shù)(FS)、左心室舒張末期內徑(LVDd)、左心室收縮期內徑(LVDs)、左心室舒張末期容積(LVVd)和左心室收縮末期容積(LVVs)［7-8］。

2.2 免疫組化分析 麻醉后灌流取心臟，經過固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后，切片(厚4～5 μm)，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min，蒸餾水洗3次，抗原修復，以正常山羊血清室溫孵育20 min封閉，滴加稀釋一抗ED-1抗體(1∶400)，CD11b抗體(1 ∶400)。37℃孵育2 h，PBS液沖洗，HRP室溫孵育30 min，PBS液沖洗，DAB顯色，蒸餾水洗滌后以蘇木素復染，脫水，透明，封片［9］。顯微鏡下觀察，染色明顯的組織切片胞質內出現(xiàn)棕色定位明確的顆粒物質為陽性細胞表達。250倍放大，圖像分析時每個切片取5個視野，剔除染色不均，皺褶圖像。

2.3 Western blot 低溫下將心臟組織剪碎，加入RIPA蛋白裂解液(含蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)快速勻漿、裂解、離心提取組織塊中總蛋白，用BCA法定量，95℃變性5 min。取等量樣本上樣于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白質轉移至PVDF膜上［10］。免疫反應:搖床上搖動封閉1 h，然后加入 β-actin、IκBα 和 NF-κB 的一抗(均為1∶1 000稀釋)，4℃過夜。次日，室溫下TBST洗膜，二抗反應1 h后洗膜、曝光顯影。以βactin作內標參考，灰度分析。

2.4 ELISA試劑盒 小鼠麻醉灌流取心臟，加入生理鹽水，用手術剪將組織剪碎，勻漿器勻漿。10 000 r·min-1，5 min離心取組織液上清。根據(jù)試劑盒說明書操作［11］，酶標儀450 nm波長處測定吸光度(A)值。

Tab 1 Cardiac function measured by echocardiography

3 結果

3.1 超聲心動測小鼠心功能 超聲心動結果顯示不同濃度的三七皂苷R1能有效地防止LPS引起的心肌功能的衰退，且其作用存在劑量依賴性。從射血分數(shù)(EF)和縮短分數(shù)(FS)結果可以看出，與正常組相比，模型組的EF和FS都明顯降低，模型組心肌收縮功能明顯改變(P＜0.05);與模型組相比，三七皂苷R1高劑量組(25 mg·kg-1)處理后EF和FS明顯恢復(P＜0.05)，見Tab 1。

3.2 免疫組化分析ED-1+炎性細胞的浸潤 巨噬細胞作為心肌組織的主要炎癥浸潤細胞存在于許多原發(fā)和繼發(fā)性心臟疾病中。LPS刺激后，使巨噬細胞同血管內皮細胞間粘附性加強，進而透過血管內皮，進入心肌組織中，導致局部炎癥反應。對小鼠進行ED-1(單核巨噬細胞特異性抗原)染色可以看出，與正常組相比，模型組心肌組織中單核巨噬細胞的量增加了2倍;與模型組相比，高劑量三七皂苷R1(25 mg·kg-1)預處理組中單核巨噬細胞的量明顯減少(P＜0.05)。R1明顯抑制了炎癥反應中單核巨噬細胞在心肌細胞間的聚集。單給藥組與正常組相比無明顯差別，見Fig 1。

3.3 免疫組化分析CD11b+炎性細胞的浸潤 白細胞和中性粒細胞明顯增高是炎癥反應的特征之一。正常情況下，CD11b(一種白細胞黏附因子)僅在單核細胞和中性粒細胞膜上呈低特異性表達，LPS刺激后，這些細胞被激活，通過與內皮細胞表達的細胞間黏附因子-1(ICAM-1)相互作用而介導白細胞和內皮細胞黏附，繼而損傷組織。通過量化心肌組織中白細胞和中性粒細胞可反映小鼠炎癥情況。CD11b染色結果顯示，與正常組相比，中性粒細胞和巨噬細胞的量在LPS誘導后增加了14倍;與模型組相比，高劑量三七皂苷R1(25 mg·kg-1)預處理后，中性粒細胞和巨噬細胞的量降低到模型組的1/7，抑制了中性粒細胞和巨噬細胞的大量增加，見Fig 2。

Fig 1 Immunohistochemical scoring of LPS-induced leukocyte accumulation within postcapillary venules of the heart after Notoginsenoside R1 treatment

Fig 2 Immunohistochemical scoring of LPS-induced leukocyte accumulation within postcapillary venules of the heart after Notoginsenoside R1 treatment

3.4 心肌中 IκBα 和 NF-κB活性的變化 通過Western blot法檢測心臟組織蛋白中IκBα和NF-κB的表達。如Fig 3A所示，LPS處理后2 h內IκBα的表達隨時間降低。應用三七皂苷R1后，可明顯抑制IκBα降解。與0時相比，在2 h內IκBα的表達沒有明顯變化。由此可知，三七皂苷R1對LPS誘導的IκBα的降解有抑制作用。

如Fig 3B所示，LPS作用下，NF-κB p-65亞基的磷酸化明顯增多，應用三七皂苷R1后抑制了NF-κB的活化。NF-κB是一種細胞內重要的核轉錄因子，通常以無活化形式存在于細胞質中，活化后廣泛參與炎癥反應［12］。VCAM-1、ICAM-1基因的誘發(fā)依賴于轉錄因子NF-κB的激活。實驗結果表明，高劑量三七皂苷R1(25 mg·kg-1)能阻斷NF-κB信號通路，抑制NF-κB活化入核，避免心肌細胞受到過量炎癥因子的影響，見Fig 3。

3.5 ELISA 測 TNF-α、IL-1β、VCAM-1 和 ICAM-1 腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細胞介素(IL-1β)是引起心肌損傷最重要的細胞因子。我們通過ELISA試劑盒的方法檢測TNF-α水平，發(fā)現(xiàn)在LPS刺激2 h后有明顯的提升，8 h后回歸到正常水平。中劑量(12.5 mg·kg-1)、高劑量(25 mg·kg-1)的三七皂苷R1能有效抑制LPS刺激后TNF-α和IL-1β水平的升高，且其作用呈劑量依賴性(P＜0.05)。血管細胞黏附因子(VCAM-1)和細胞間黏附因子(ICAM-1)參與中性粒細胞黏附心肌細胞釋放細胞毒過程，在心肌損傷過程中起關鍵作用。實驗結果發(fā)現(xiàn)三七皂苷R1也能抑制LPS處理后心肌組織中VCAM-1、ICAM-1的增長(P＜0.05)。單給藥組與正常組差異無顯著性。見Tab 2。

Fig 3 Effect of Notoginsenoside R1 on LPS-induced myocardial IκBα (A)and NF-κB(B)activation

Tab 2 TNF-α，IL-1β，VCAM-1 and ICAM-1 levels in cardiac tissue by ELISA(±s，n=8)

Tab 2 TNF-α，IL-1β，VCAM-1 and ICAM-1 levels in cardiac tissue by ELISA(±s，n=8)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs model.

Group TNF-α/ng·L-1 IL-1β/ng·L-1 VCAM-1/ng·L-1 ICAM-1/ng·L -1 Ctrl 42.5±6.6 36.2±0.2 89.9±9.4 74.1±16.4 LPS 376.3±14.6* 199.4±13.1*612.4±14.9*1049.2±17.7*LPS+R1 5 mg·kg-1 355.9±7.2 171.4±2.1# 572±23.7 994.5±29.3 LPS+R1 12.5 mg·kg-1 136.3±11.9# 87.8±5.5# 299.7±7.8# 329.1±2.9#LPS+R1 25 mg·kg-1 86.2±9.4# 41.6±6.5# 112.7±11.2# 99.7±14.6#Positive drug 48.1±12.5# 39.5±5.9# 109.6±10.6# 80.1±19.1#

4 討論

實驗結果顯示:LPS組小鼠心肌組織中TNF-α等炎癥因子以及CD11b等炎性細胞水平均升高，心肌收縮功能發(fā)生改變，提示內毒素LPS可導致心肌細胞釋放炎癥因子，誘導炎性細胞浸潤，最終導致心功能的下降。三七皂苷R1對心肌組織中TNF-α等炎癥因子的水平具有降低作用，能明顯抑制心肌組織中中性粒細胞及單核巨噬細胞等炎性細胞的大量浸潤，并明顯改善心功能，產生心臟保護作用。

近年研究表明，心臟移植、體外循環(huán)感染等因素可誘發(fā)機體內內毒素水平升高，引發(fā)心肌炎癥［13］。抑制炎癥因子的激活對于心肌損傷的防治有重要價值。過量炎性細胞因子之間相互作用產生網絡效應，導致炎癥反應，是心肌組織損傷的病理基礎之一。大量的中性粒細胞能釋放過量的炎癥因子和細胞因子，加重炎癥反應，并吸引更多的中性粒細胞進入組織，形成惡性循環(huán)，導致組織完全被破壞。文獻顯示，LPS刺激會使細胞因子VCAM-1和ICAM-1表達上調［14］。本實驗結果顯示，三七皂苷R1作用后能抑制以上細胞因子的表達，阻止局部中性粒細胞和巨噬細胞的大量侵入。

三七皂苷R1能夠降低LPS處理之后心肌組織中升高的細胞因子TNF-α水平。TNF-α是一種自分泌的作用因子，在炎癥反應中參與了心肌損傷的形成和發(fā)展，其表達水平在LPS刺激后增高，促進了白細胞和內皮細胞的黏附和相互作用，使粒細胞向炎癥區(qū)域的浸潤大大增加，從而導致心肌損傷［15］。巨噬細胞的激活使得心肌細胞中產生TNF-α，實驗結果可以看出三七皂苷R1可以抑制LPS誘導產生TNF-α和IL-1β，防止心肌受損。因此推斷，TNF-α可能是一個直接可對心肌產生抑制作用的細胞因子。

本實驗發(fā)現(xiàn)，三七皂苷R1的作用是通過抑制轉錄因子NF-κB的活化來預防炎癥發(fā)生的。現(xiàn)已證實，心肌梗死的過程中，NF-κB是調節(jié)細胞因子、趨化因子和黏附因子表達的關鍵分子。梗死發(fā)生后，NF-κB激活轉移入核，與DNA鏈上的特異性部位結合，進而啟動炎癥因子等相關基因轉錄，從而調控 ICAM-1、VCAM-1、TNF-α 和 IL-1β 等炎癥因子的表達［16］。由此可預見，三七皂苷R1有可能用于治療因NF-κB的轉錄引起的病癥，如缺血/再灌注損傷、心肌細胞凋亡等。已有報道，NF-κB的抑制劑能夠有效治療內毒素引起的炎癥反應。抑制NF-κB的活化，將對心肌組織起到一定的保護作用。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)三七皂苷R1能夠阻止由內毒素LPS引起的心肌收縮功能減弱，抑制炎癥反應的發(fā)生，防止心肌損傷。我們可以嘗試將三七皂苷R1的抗炎特性開發(fā)作為組織受損、器官衰竭的抑制劑。因此，我們可以把三七皂苷R1應用于預防由炎癥引起的心肌損傷，在臨床上具有一定應用前景。

［1］袁紅艷，張 曄，王 丹，崔炯漠等.柞樹皮對脂多糖和D-氨基半乳糖誘導敗血癥休克小鼠的保護作用［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22:2886-7.

［1］Yuan H Y，Zhang Y，Wang D，et al.Protective effect of quercus mongolica stem bark against sepsis shock induced by Li-popolysaccharide and D-galactosamine in mice［J］.Lishizhen Med Mat Med Res，2011，22:2886-7.

［2］Gu Q，Yang X P，Bonde P，et al.Inhibition of TNF-alpha reduces myocardial injury and proinflammatory pathways following ischemia-reperfusion in the dog［J］.Cardiovasc Pharmacol.2006，48(6):320-8.

［3］唐旭東，姜建青，劉寶玉，等.三期總皂苷對心肌缺血再灌注損傷保護作用的分子機制［J］.安徽中醫(yī)學院學報，2003，22:34-8.

［3］Tang X D，Jiang J Q，Liu B Y，et al.Molecular mechanism of protective effect of total saponins of panax notoginseny against myocardial ischemia reperfusion injury［J］.J Anhui TCM Coll，2003，22:34-8.

［4］Bhattacharya K，F(xiàn)arwell K，Huang M，et al.Mast cell deficient W/Wv mice have lower serum IL-6 and less cardiac tissue necrosis than their normal littermates following myocardial ischemia-reperfusion［J］.Int J Immunopathol Pharmacol，2007，20(1):69-74.

［5］郭鈺琪，齊冬梅，郝 鈺，等.三七皂苷R1調節(jié)炎性T細胞亞群保護血管內皮的實驗研究［J］.中國藥理學通報，2012，28(2):240-4.

［5］Guo Y Q，Qi D M，Hao Y，et al.Regulation of sanchinoside R1 on inflammatory T lymphocytes in protecting vascular endothelium lesion in ApoE-/-mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(2):240-4.

［6］Braun-Dullaeus R C，Dietrich S，Schoaff M J.Protective effect of 3-deazaadenosine in a rat model of lipopolysaccharide-induced myocardial dysfunction［J］.Shock，2003，19:245-51.

［7］Zhou H，Qian J，Li C，et al.Attenuation of cardiac dysfunction by HSPA12B inendotoxin-induced sepsis in mice through a PI3k-dependent mechanism［J］.Cardiovascul Res，2011，89:109-18.

［8］葉 強，陳良海，劉應才，等.辛伐他汀通過Akt/GSP3β 通路抑制心肌梗死后心肌細胞凋亡［J］.中國藥理學通報，2011，27(12):1656-60.

［8］Ye Q，Chen L H，Liu Y C，et al.Inhibitory effect of simvastatin on cardiomyocyte apoptosis through Akt/GSK3β pathway after myocardial infraction［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(12):1646-60.

［9］羅國剛，樊文靜，袁興運，等.天麻皂苷對三叉神經節(jié)離體培養(yǎng)后降鈣素基因相關肽表達影響的機制研究［J］.藥學學報，2011，46(12):1451-6.

［9］Luo G G，F(xiàn)an W J，Yuan X Y，et al.The pharmacological mechanism of gastrodin on calcitonin gene-related peptide of cultured rat trigeminal ganglion［J］.Acta Pharm Sin，2011，46(12):1451-6.

［10］許成芳，李小毛，李 田，王小韻.紫杉醇對PTEN不同狀態(tài)的子宮內膜癌細胞株的作用及其機制探討［J］.中國藥理學通報，2011，27(11):1528-32.

［10］Xu C F，Li X M，Li T，Wang X Y.The effect of taxol on endometrial cancer cells with different PTEN status［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(11):1528-32.

［11］Cao W J，Zhang W，Liu J J，Wang Y.Paeoniflorin improves survival in LPS-challenged mice through the suppression of TNF-αand IL-1β release and qugmentation of IL-10 productiom［J］.ELISEVIER，2011，11:172-8.

［12］龍石銀，張彩平，高細強，等.NF-κB/IκB在二苯乙烯苷抑制過氧化氫誘導內皮細胞凋亡中的表達變化［J］.中國藥理學通報，2011，27(10):1353-7.

［12］Long S Y，Zhang C P，Gao X Q，et al.Effects of 2，3，5，4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-Aglucoside on the NF-κB/IκB and apoptosis of HUVECs induced by H2O2［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(10):1353-7.

［13］安群星，賈 宏，劉利兵，等.己酮可可堿對內毒素血癥大鼠心肌炎癥的抑制作用［J］.廣東醫(yī)學，2004，25(12):1386-7.

［13］An Q X，Jia H，Liu L B，et al.Protective effect of pentoxifylline on the inflammation of myocardium in endotoxemia-affected rats［J］.Guangdong Med J，2004，25(12):1386-7.

［14］Henninger D D，Panes J，Eppihimer M，et al.Cytokine-induced VCAM-1and ICAM-1expression in different organs of the mouse［J］.J Immunol，1997，158:1825-32.

［15］Sugano M，Hata T，Tsuchida K，et al.Local delivery of soluble TNF-alpha receptor 1 gene reduces infarct size following ischemia/reperfusion injury in rats［J］.Mol Cell Biochem，2004，266(1/2):127-32.

［16］張翼冠，李曉輝，樊繼山，等.三七總皂苷通過抗炎和調血脂作用抑制大鼠動脈粥樣硬化形成［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2007，7(11):1601-5.

［16］Zhang Y G，Li X H，F(xiàn)an J S，et al.The inhibitory effect of total saponins of panax notoginseng on rats with atherosclerosis［J］.Prog Mord Biomed，2007，7(11):1601-5.