丙戊酸對人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用研究

邵翠杰，楊俊霞

(江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221002)

丙戊酸(2-propylpentanoic acid，VPA)為經(jīng)典的廣譜抗癲癇藥，是腦腫瘤手術(shù)后的常規(guī)用藥。有研究顯示［1］，它具有抑制組蛋白去乙酰化酶作用，組蛋白乙酰化修飾與腫瘤發(fā)生有關(guān)。組蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferase，HATs)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDAC)參與決定組蛋白乙酰化狀態(tài)［2］。HDAC是多亞基抑制物復(fù)合體的一部分，促使組蛋白去乙酰化，抑制基因轉(zhuǎn)錄;通過介導(dǎo)核小體結(jié)構(gòu)改變和調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與細(xì)胞周期進(jìn)程和分化，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［3］。近年來發(fā)現(xiàn)［4］，HDAC抑制劑具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用。如果能夠證明 HDAC抑制劑——VPA在臨床有效預(yù)防癲癇(1.0 mmol·L－1)的同時對膠質(zhì)瘤也具有抑制增殖、促進(jìn)分化、誘導(dǎo)凋亡等抗腫瘤作用，在臨床上將達(dá)到一藥多用，老藥新用的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SF295和U87(來源于中山大學(xué)神經(jīng)腫瘤實(shí)驗(yàn)室)用于本研究。RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibcol公司)。四甲基偶氮噻唑藍(lán)［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide，MTT］、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、瓊脂糖、甲酰胺、過硫酸胺均購于美國Sigma公司;兔抗人單克隆抗體乙酰化H3、H4(Cell-signaling公司);丙戊酸(美國Sigma公司)。超凈工作臺、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Shel Lab)(日本SANYO公司)、酶標(biāo)儀(Model 550 Bio-Rad)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)，流式細(xì)胞儀(BD FACS ∶Calibur)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SF 295、U 87，用含有體積分?jǐn)?shù)為0.10胎牛血清的培養(yǎng)液(Roswell Park Memorial Institute，RPMI 1640)在37℃、體積濃度0.05 CO2、0.95飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。將細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，接種入96孔板中，100 μl/孔，每孔2 ×103～3 ×103個細(xì)胞。觀察細(xì)胞的生長和貼壁情況。

1.2.2 藥物處理 用純乙醇將VPA稀釋成為儲存液(62.9 mmol·L－1)4℃冰箱保存。臨用前用培養(yǎng)液稀釋使其終濃度為0.2 mmol·L－1(腦脊液藥物濃度)、0.6 mmol·L－1(血漿藥物濃度)、1.0 mmol·L－1(抗癲癇藥物濃度上限)、1.5 mmol·L－1、2.0 mmol·L－1、2.7 mmol·L－1(最小中毒濃度，開始出現(xiàn)嗜睡)、3.6 mmol·L－1(中毒濃度，開始出現(xiàn)昏迷)、4.5 mmol·L－1共8個不同濃度。處理細(xì)胞d 1－7，次日開始取96孔板做 MTT測定。每個濃度設(shè)置3個平行孔，重復(fù)3次。空白對照組含有同濃度的乙醇(濃度低于0.001 mmol·L－1)。

1.2.3 藥物敏感性試驗(yàn) MTT法檢測藥物對細(xì)胞活性的影響，酶標(biāo)儀測定其光密度(optical density，OD)值。按照下列公式計算抑制率:抑制率/%=(1－試驗(yàn)組OD值)/(對照組OD值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 檢測細(xì)胞周期及凋亡 血清饑餓法對數(shù)生長的SF 295、U 87細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞周期同步化處理。然后加入VPA使之終濃度為1.0、2.0 mmol·L－1，分別于 d 1、d 3、d 5、d 7 收集細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測周期變化以及細(xì)胞凋亡率，Mod Fit軟件分析周期，Cell Quest軟件分析凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot 檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá):收集處理不同時間段的SF 295、U 87細(xì)胞，0.002 HCL提取細(xì)胞組蛋白，細(xì)胞裂解液處理提取細(xì)胞總蛋白。然后蛋白變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、兔抗人乙酰化組氨酸 H3、H4(1∶500稀釋)封閉過夜;鼠抗人β-actin做為內(nèi)參(1∶5 000)。再加入1∶5 000羊抗兔、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗孵育，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 VPA抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長 VPA對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SF 295、U 87有抑制增殖作用，而且具有時間依賴性和濃度依賴性。其IC50值分別是 4.97、4.57 mmol·L－1。

配對t檢驗(yàn)結(jié)果表明，1.0 mmol·L－1VPA對SF 295細(xì)胞抑制率的時間依賴性差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.121，P=0.072)，但是對U 87細(xì)胞株抑制率的時間依賴性差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.516，P=0.046)(Fig 1)。

2.2 VPA誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯 1.0 mmol·L－1VPA對膠質(zhì)瘤的細(xì)胞周期動力學(xué)產(chǎn)生影響，S期細(xì)胞減少，G1、G2/M期細(xì)胞數(shù)量相對增加，尤其對G2期阻滯作用具有明顯的時間依賴性。藥物作用24 h即出現(xiàn)明顯S期細(xì)胞減少，G1、G2/M期細(xì)胞相對增多。配對t檢驗(yàn)，1.0 mmol·L－1VPA對U 87細(xì)胞周期阻滯作用具有統(tǒng)計學(xué)意義(72 h后G2期細(xì)胞比例與對照組比較)(t=2.72，P=0.031);對SF 295細(xì)胞周期阻滯作用沒有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.03，P=0.088)(Tab 1，F(xiàn)ig 2)。

Tab 1 Effects of 1.0 mmol·L-1VPA on cell cycle arrest ofG2-phase on glioblastoma cell lines(%，±s)

Tab 1 Effects of 1.0 mmol·L-1VPA on cell cycle arrest ofG2-phase on glioblastoma cell lines(%，±s)

*P＜0.05 vs U87 non VPA group

G2phase non VPA d 1 d 3 d 5 d 7 SF295 13.4 ±4.03 14.2 ±4.02 14.6 ±4.03 15.9 ±3.02 16.4 ±4.04 U87 10.5 ±3.05 13.4 ±5.01 17.8 ±6.1* 20.7 ±4.04*22.1 ±6.01*

2.3 VPA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 1.0 mmol·L－1VPA誘導(dǎo)出現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡極少;≥2.0 mmol·L－1VPA可以誘導(dǎo)出現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，且具有時間依賴性。U87細(xì)胞，藥物處理d 7后凋亡細(xì)胞(0.072)的比例是未處理組(0.012)的6倍(t=4.02，P=0.005)。SF 295細(xì)胞藥物處理72 h內(nèi)未見凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，d 7凋亡細(xì)胞比例比對照組增加1.3倍(t=1.92，P=0.407)，但差異有顯著性(Tab 2)。

Fig 1 Effects of VPA on the viabilities of SF295，U87 time and concentration-dependently(VPA 1.0 mmol·L-1)

Tab 2 Effects of 2.0 mmol·L －1VPA on cell apoptosis of glioblastoma cell lines(% ， ± s)

Tab 2 Effects of 2.0 mmol·L －1VPA on cell apoptosis of glioblastoma cell lines(% ， ± s)

*P＜0.05 vs U87 non VPA group

Apoptosis non VPA d 1 d 3 d 5 d 7 SF295 5.8 ±1.03 2.9 ±1.02 5.6 ±2.03 7.9 ±3.02 15.1 ±3.04 U87 1.2 ±0.25 1.1 ±0.51 2.2 ±0.17 3.9 ±1.04 7.1 ±2.01*

2.4 VPA誘導(dǎo)組蛋白H3、H4表達(dá) 乙酰化組蛋白H3、H4在正常膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中有少量表達(dá)。1.0 mmol·L－1的 VPA 作用于 SF 295、U 87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株24 h后可以見到明顯增加的乙酰化組蛋白H3、H4表達(dá)，直觀表現(xiàn)為條帶增粗，且隨著時間延長表達(dá)量增加(Fig 3)。

Fig 2 Effects of 1.0 mmol·L－1VPA on cell cycle arrest of glioblastoma cell lines SF295，U87

Fig 3 Effects of 1.0 mmol·L －1VPA on acylated H3/H4 of glioblasma cell lines

3 討論

丙戊酸是腦腫瘤術(shù)后用于預(yù)防癲癇的常規(guī)藥物，其是否具有抗膠質(zhì)瘤作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 VPA(1.0 mmol·L－1，臨床用于治療癲癇的常規(guī)濃度)對惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SF 295、U 87具有抑制生長增殖，周期阻滯作用，并且可以在蛋白水平改變乙酰化組蛋白的表達(dá)水平;增大劑量還可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。提示VPA在用于抗癲癇的同時，可能對膠質(zhì)瘤的治療發(fā)揮一定的作用。

HDAC抑制劑主要是通過改變組蛋白的乙酰化程度來改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控基因表達(dá)［5］。VPA為HDAC抑制劑的一種，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制可能是:抑制HDAC活性，使組蛋白不能處于去乙酰化的狀態(tài)，打破了乙酰化與去乙酰化之間的平衡，從而細(xì)胞核組蛋白乙酰化水平相對提高，激活核小體內(nèi)一些相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄，從而將細(xì)胞阻滯在G1或者G2/M期，防止出現(xiàn)異常增殖而具有抗腫瘤作用。Li等［6］在髓母細(xì)胞瘤的研究過程中發(fā)現(xiàn)，VPA抑制腫瘤的作用與其誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯相關(guān)，VPA使乙酰化組蛋白H3和H4增加可能是重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株在VPA處理后乙酰化組蛋白H3和H4明顯增加。乙酰化組蛋白的增加能夠使染色體保持高度乙酰化，核小體內(nèi)染色體處在松弛狀態(tài)，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合，使一些受抑制的基因重新恢復(fù)表達(dá)，發(fā)揮治療腫瘤的作用。因此，與其他HDAC抑制劑(TSA、丁酸鹽等)相似［7］，VPA 可能是通過改變腫瘤細(xì)胞組蛋白乙酰化狀態(tài)來改變相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而具有抗腫瘤作用。

目前對于VPA抗腫瘤的研究仍在進(jìn)行中。本研究結(jié)果提示在臨床抗癲癇的濃度(1.0 mmol·L－1)不能誘導(dǎo)出現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，而增加藥物濃度(1.5 mmol·L－1)會誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞出現(xiàn)自噬現(xiàn)象［8］，(2.0 mmol·L－1)就會誘導(dǎo)凋亡的出現(xiàn)，具體機(jī)制并不是很清楚。雖然增加VPA的濃度可以誘導(dǎo)出現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬和凋亡，但是由于在臨床用于抗癲癇的過程中，血藥濃度不可能大于1.0 mmol·L－1的濃度，腦脊液中更不可能達(dá)到此濃度，因而本實(shí)驗(yàn)沒有進(jìn)一步進(jìn)行關(guān)于大劑量、高濃度VPA誘導(dǎo)凋亡機(jī)制的研究。

VPA作為脫乙酰化酶抑制劑，可能是很有意義的膠質(zhì)瘤病人臨床輔助用藥。

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