細胞色素P450 2E1在依達拉奉減輕免疫性肝損傷氧化應激中的作用

陳方軍，李 俊

(1.安慶醫藥高等專科學校臨床醫學系，安徽安慶 246052;2.安徽醫科大學藥學院，安徽合肥 230032)

肝內免疫反應是病毒性肝損傷的重要機制之一，刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)可引起肝細胞膜脂質過氧化、氧自由基表達上調，導致肝細胞結構破壞和功能障礙，肝細胞變性、壞死，引起急性免疫性肝損傷［1］。依達拉奉是目前在臨床試驗中證明效果優越的自由基清除劑［2］，在對多種臟器損傷保護作用的研究中均提示自由基清除和抑制脂質過氧化的作用是其重要作用機制。因此，本課題擬采用Con A致小鼠急性免疫性肝損傷模型，探討依達拉奉對急性實驗性肝損傷的保護作用和部分機制，以期為進一步拓寬依達拉奉的臨床應用提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 化學試劑 ConA購自 Sigma公司，規格為100mg;依達拉奉注射液由吉林博大制藥公司提供;丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TB)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;DEPC H2O、TRIzol試劑購自Invitrogen公司;RT－PCR試劑盒購于Promega公司，特異性引物由上海生物工程技術和服務公司合成;CYP 2E1抗體購于Upstate公司。

1.2 主要儀器 美國Biometra公司垂直電泳系統和梯度PCR儀;DU2600紫外分光光度計，BECKMAN公司;高速冷凍離心機，BECKMAN公司。

1.3 動物處理 BALB/c小鼠60只，♂，體質量18～22 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗前適應性喂養1周，自由飲食，維持12 h光照和12h黑暗的晝夜節律，溫度20℃ ～25℃，相對濕度(50±5)%。將健康小鼠隨機分為6組，每組10只:正常對照組、Con A肝損傷組、依達拉奉(4、8、16 mg·kg－1)處理組、還原性谷胱甘肽(50 mg·kg－1)處理組。所有小鼠在給藥前均禁食1 h，給藥組于給予Con A前24 h、8 h和1 h分別腹腔注射相應劑量依達拉奉和還原性谷胱甘肽。正常組小鼠尾靜脈注射PBS溶液0.3 ml，其他各組按 Con A 20 mg·kg－1以PBS溶液稀釋為0.3 ml尾靜脈注射造模，在末次給藥后禁食6 h取材，眼眶靜脈叢采血，血清用來測生化指標;頸椎脫臼處死小鼠，取相同部位肝臟用于總RNA的提取、蛋白質免疫印跡分析和組織病理學檢查。

1.4 血清肝生化指標檢測 血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)檢測嚴格按試劑盒規范操作。

1.5 肝組織病理檢查 肝組織置于4%多聚甲醛中固定。經乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、5 μm連續切片、HE染色、中性樹脂封片后，光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理改變。

1.6 肝勻漿SOD活力、GSH水平、MDA含量檢測用冷生理鹽水制備10%肝勻漿，檢測肝組織中SOD活力及GSH、MDA含量。GSH水平用Griffith法檢測。通過測定脂質過氧化的羰基產物MDA含量反映組織的氧化應激水平，MDA含量測定采用TBARS 比色法［3］。

1.7 總RNA的分離和逆轉錄 50 mg小鼠肝臟組織用TRIzol試劑盒提取總RNA。DNA酶消化基因組DNA。通過測定260 nm波長下樣品的吸光度值確定樣品中RNA含量，用瓊脂糖凝膠電泳技術檢測RNA的完整性。每份樣品中取1 μg總RNA用于合成cDNA。20 μl逆轉錄反應體系中含25 mmol·L－1Tris · HCl(pH 8.3)、37.5 mmol·L－1KCl、10 mmol·L－1DTT、1.5 mmol·L－1MgCl2、10 mmol·L－1dNTP、0.5 mg oligo(dT)15引物及 20 U 逆轉錄酶。反應體系在42℃孵育60 min后，在95℃中止逆轉錄反應。

1.8 PCR擴增 50 μl PCR反應體系中含2.5 μl cDNA、1 × PCR 緩沖液、1.5 mmol·L－1MgCl2、200 μmol·L－1dNTP混合物、1 U耐熱性DNA聚合酶、1 μmol·L－1正向引物和逆向引物。使用GAPDH做內對照。CYP2E1基因引物序列:正向，5'-AGT GTT CAC ACT GCA CCT GG-3';逆向，5'-CCT GGA ACA CAG GAA TGT CC-3'，片段長度為125 bp。GAPDH基因引物序列為:正向，5'-GAG GGG CCA TCC ACA GTC TTC-3';逆向，5'-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG-3'，片段長度為340 bp。CYP2E1擴增條件為:94℃預變性3 min，1個循環;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃ 延伸 1 min，35 個循環。GAPDH PCR擴增條件為:94℃預變性3 min，1個循環;94℃變性30 s，56℃退火30s，72℃ 延伸 1 min，30 個循環。末次循環后 72℃孵育 10 min。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg·L－1溴化乙錠)電泳45 min后鑒定分析。

1.9 蛋白質免疫印跡 稱取0.1 g肝臟組織樣品，加入1 ml RIPA 裂解液(pH 7.4，50 mmol·L－1Tris-HCl、150 mmol·L－1NaCl、1% 脫氧膽酸鈉、1%Triton X-100、0.1%SDS、1 mmol·L－1EDTA 和 1 mmol·L－1PMSF)置于冰上勻漿裂解 30 min，再以15 000×g離心15 min，取上清液后蛋白定量至10 g·L－1，接著加入2×上樣緩沖液混勻，沸水浴5 min使蛋白變性，－20℃貯存。50 μg蛋白樣品經10%SDS-PAGE凝膠垂直電泳分離后電轉移至PVDF膜上，膜于5%脫脂牛奶中4℃封閉過夜后室溫孵育一抗CYP2E1(1 ∶2 500)、或 β-actin(1 ∶2 000)2 h，以DPBS-T洗膜40 min，接著將膜于室溫孵育二抗(山羊抗兔IgG)2 h，以DPBS-T洗膜40 min后再以DPBS浸洗10 min。最后用化學發光法(ECL)顯跡，X線壓片曝光成像。

1.10 統計學處理 CYP2E1 mRNA水平以內參GAPDH標準化，對照組的光密度標定為 1。CYP2E1蛋白水平以內參β-actin標準化，對照組的光密度值標定為1。所有計量資料試驗結果用±s的方式表示，方差分析和SNK方法檢驗各組之間差異。

2 結果

2.1 依達拉奉對免疫性肝損傷小鼠血清生化指標的影響 見Tab 1，與正常組相比，ConA模型組大鼠血清 ALT、AST 明顯升高，依達拉奉(4、8、16 mg·kg－1)、還原性谷胱甘肽處理組血清ALT、AST水平均較正常組升高，比模型組有明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)。(Tab 1)

Tab 1 Effects of edaravone on serum ALT and AST concentration in mice with ConA-induced immune hepatic injury(±s，n=10)

Tab 1 Effects of edaravone on serum ALT and AST concentration in mice with ConA-induced immune hepatic injury(±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model;△△P＜0.01 vs normal

Group Dose/mg·kg－1 ALT/U·L－1 AST/U·L －1 Normal 0 29.6 ±1.8 59.3 ±3.9 Model 0 41.6 ±2.6△△ 91.5 ±4.8△△Edaravone 4 37.5 ±2.9* 78.6 ±4.7*8 36.2 ±2.7* 72.8 ±4.2*16 31.6 ±2.6＊＊ 65.5 ±5.2＊＊GSH 50 32.7 ±3.9* 66.8 ±5.7＊＊

2.2 依達拉奉對免疫性肝損傷小鼠引起肝臟組織脂質過氧化和GSH消耗、SOD活力的影響 結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠肝勻漿中MDA的含量明顯上升，而SOD活性、GSH的含量明顯降低。與模型組比較，依達拉奉(8、16 mg·kg－1)能明顯降低用藥組小鼠肝勻漿中MDA的含量，明顯升高SOD活性和GSH含量(P＜0.01，Tab 2)。

Tab 2 Effects of edaravone on MDA，SOD and GSH in liver homogenate in mice with Con A-induced immune hepatic injury(±s，n=10)

Tab 2 Effects of edaravone on MDA，SOD and GSH in liver homogenate in mice with Con A-induced immune hepatic injury(±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model;△△P＜0.01 vs normal

Group Dose/mg·kg－1 MDA/μmol·g－1Pro SOD/U·mg－1Pro GSH/mg·g－1Pro Normal 0 3.01 ±0.35 23.01 ±0.57 5.21±0.27 Model 0 7.23±1.11△△ 15.11±1.66△△ 2.96±0.36△△Edaravone 4 6.01 ±0.81＊＊ 16.45 ±2.02* 3.32±0.23*8 4.95±0.35＊＊ 18.24±0.88＊＊ 3.77 ±0.25＊＊16 3.74±0.71＊＊ 19.41±1.09＊＊ 4.32±0.63＊＊GSH 50 3.62±0.34＊＊ 20.85±0.63＊＊ 4.45±0.42＊＊

2.3 依達拉奉對小鼠肝臟病理組織學變化的影響

如Fig 1所示，正常組小鼠肝小葉結構清晰，肝細胞索排列整齊，未見變性與壞死。模型組輕度空泡變性，肝小葉界限模糊，炎細胞浸潤，部分位置細胞核溶解、壞死。還原性谷胱甘肽處理組病變較輕，但仍有少量標本炎細胞浸潤和散在點狀壞死;依達拉奉小劑量組各標本均有散在點狀壞死、輕度脂肪變性和炎性細胞浸潤;依達拉奉中劑量組未見散在點狀壞死，各標本仍見少量炎性細胞浸潤和輕度脂肪變性;依達拉奉大劑量組肝細胞排列較整齊，肝細胞損傷程度明顯減輕，炎性細胞浸潤顯著減少。

Fig 1 Effects of edaravone on liver histopathology in mice with ConA-induced immune hepatic injury(HE stained，×200)

2.4 依達拉奉對免疫性肝損傷小鼠肝臟組織CYP 2E1 mRNA水平的影響 結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織CYP 2E1 mRNA明顯上升(P＜0.01);與模型組相比，依達拉奉(8、16 mg·kg－1)處理組降低了肝臟組織CYP 2E1 mRNA表達(P＜0.01，Fig 2)。

2.5 依達拉奉對肝臟組織CYP 2E1蛋白表達水平的影響 結果顯示，與模型組相比，依達拉奉組(8、16 mg·kg－1)明顯的抑制了肝臟組織CYP 2E1蛋白表達水平。

Fig 2 mRNA expression of CYP2E1 in the mouse liver tissue of each group

Fig 3 Expression of CYP2E1 protein level in mouse liver tissues of each group

3 討論

ConA誘發的小鼠免疫性肝損傷是常用的肝損傷實驗動物模型。ConA是對肝細胞具有特異性毒性作用的植物凝集素，其基本病理特點是在體外可激活T細胞的絲裂原而致免疫性肝損傷，與人類慢性肝炎病變非常接近，且有肝臟特異性和靶向性，因此非常適合研究人類病毒性肝炎、自身免疫性肝病等的病理機制和進行抗肝損傷的藥物篩選［4］。本實驗血清學顯示ConA模型組肝細胞損傷，轉氨酶升高;病理學提示，肝細胞水腫、氣球樣變性、炎性細胞浸潤，符合病毒性肝炎、自身免疫性肝病等的表現。

依達拉奉對自由基毒性損傷具有強大的抑制作用，在神經系統疾病腦出血、腦梗死等疾病具有確切療效，能夠減輕自由基導致的級聯損傷，由于其獨特的清除自由基作用，其適應證臨床應用更加廣泛［5］。本文在BALB/c小鼠預防性給予依達拉奉后，與模型組比較，依達拉奉能明顯降低ConA小鼠血清ALT、AST水平，病理組織學檢查顯示小鼠肝臟的炎癥程度明顯減輕。提示依達拉奉對免疫性肝損傷小鼠具有明顯的治療作用。

SOD是保護肝臟細胞器免受自由基攻擊的重要的抗氧化物質，MDA是脂質代謝的終產物，具有很強的細胞毒性，GSH水平反映機體抗氧化能力，其下降表明機體抗氧化能力下降，生成自由基增加［6－7］。本實驗結果顯示依達拉奉可以明顯升高免疫性肝損傷小鼠肝臟SOD水平，減少MDA的生成，升高了降低的GSH水平，減輕脂質過氧化反應，改善由過氧化反應引起的肝損傷。提示依達拉奉防治小鼠免疫性肝損傷的機制可能與其提高機體抗氧化能力、保護肝細胞器免受自由基的攻擊有關。

CYP450酶系是機體中催化外來物進行代謝的主要酶系，可通過氧化或環氧化反應產生有害的代謝產物。CYP2E1是肝臟I相代謝酶細胞色素P450家族的主要亞型之一，眾多的環境化學物質進入機體后可經CYP2E1代謝活化而具有細胞毒性，許多毒物(包括致癌物)也可經 CYP2EI激活;同時，CYP2E1也是細胞色素P450中產ROS活性最強的亞型，CYP 2El可以引起許多毒性物質的代謝和激活，催化產生活性氧物質，如超氧陰離子基團和過氧化氫等，與氧化應激關系密切［8］。研究結果顯示，依達拉奉處理組明顯降低了肝臟組織CYP 2E1 mRNA表達以及CYP 2E1蛋白水平，提示抑制肝臟CYP2E1過度表達是依達拉奉治療免疫性肝損傷的機制之一，通過調節CYP450的功能來調節免疫性肝損傷的氧化代謝，減少氧自由基的生成，減弱氧化應激損傷，從而起到一定的肝臟保護作用。

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