綠原酸及其同分異構體對人血漿阿司匹林酯酶活性的影響

戴國梁，馬世堂，居文政，程小桂，謝麗艷，徐 潔，談恒山

(1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京 210029;2.南京中醫藥大學附屬醫院臨床藥理科，江蘇南京 210029;3.南京軍區總醫院臨床藥理科，江蘇 南 京 210002)

阿司匹林又名乙酰水楊酸，在臨床使用已有100多年歷史。早期臨床上主要作為抗炎鎮痛藥物。近年來，隨著對其藥效的不斷深入研究，其抗血小板聚集活性逐漸成為其臨床主要應用領域［1－2］，成為心血管疾病方面的一線藥物。

綠原酸(chlorogenic acid)是由咖啡酸與奎寧酸形成的縮酚酸，廣泛存在于植物中，以金銀花、杜仲中的含量較高，具有廣泛的藥理作用［3－5］。綠原酸作為一種自由基清除劑及抗氧化劑已被大量的試驗證明［6－7］。

中西藥合并使用是現代藥物治療的一大特點，若處方不當，中西藥物相互作用，可能存在不良反應，導致治療失敗。

臨床上，阿司匹林常與燈盞細辛注射液、脈絡寧注射液等中藥制劑合用，用于治療心腦血管疾病，并取得了良好的療效［8－9］。燈盞細辛注射液、脈絡寧注射液中含有一定量的綠原酸及其相似結構的化合物。

通過參考相關文獻［10］，建立了阿司匹林酯酶體外代謝系統，通過考察該類化合物對阿司匹林酯酶活性的影響，為該類化合物與阿司匹林合用的安全性提供理論支持。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀(配有G1311A四元泵、G1313A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1314A 檢測器及 Chemstation(A.10.02)工作站);梅特勒－托利多AE240電子天平(上海梅特勒－托利多有限公司);Thermo冷凍離心機(美國Thermo公司);Millipore Drict-Q5超純水機(法國Millipore公司);WH-2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)。

1.2 試藥 對照品阿司匹林(批號:100113－201104)和水楊酸(批號:100106－200303)購于中國食品藥品檢定研究院;非那西丁對照品(Sigma公司，批號:048K1586);綠原酸對照品(阿拉丁試劑(上海)有限公司，批號:25908);新綠原酸、隱綠原酸對照品(成都曼斯特生物科技有限公司);三羥甲基氨基甲烷(Tris，Wisent公司，批號:600127002)。

2 方法

2.1 標準溶液的制備 精密稱取阿司匹林對照品6.00 mg 于 10 ml量瓶中，0.01 mol·L－1的 HCl溶解稀釋至刻度，得0.600 g·L－1的阿司匹林對照品儲備液。

精密稱取水楊酸對照品6.24 mg于10 ml量瓶中，甲醇溶解稀釋至刻度，得0.624 g·L－1的水楊酸對照品儲備液。

精密稱取非那西丁對照品2.50 mg于10 ml量瓶中，甲醇溶解稀釋至刻度，得0.250 g·L－1的非那西丁對照品儲備液。精密移取適量用甲醇稀釋成0.050 g·L－1非那西丁內標溶液。

精密稱取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸適量，分別用甲醇定容至 10、1、0.5 g·L－1。

2.2 血漿阿司匹林酯酶的體外培養 精密吸取100 μl空白人血漿，加入10 μl阿司匹林溶液(120 g·L－1)，實驗組加入單體成分適量，對照組加入等量的溶媒(甲醇)后以Tris緩沖培養液(200 mol·L－1CaCl2，20 mol·L－1Tris-HCl，pH7.4)補足至 1 ml。混和均勻后放置于37℃的水浴搖床中振蕩20 min，加入20 μl非那西丁內標(0.050 g·L－1)溶液，振蕩混勻后吸取0.5 ml于離心機試管中加入等體積0.5 ml乙腈，旋渦振蕩30 s(沉淀蛋白，中止反應)，以12 000 r·min－1離心10 min 后，吸取上清液50 μl。

2.3 血漿阿司匹林酯酶活性測定的色譜條件Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);檢測波長:235 nm;流速:1.0 ml·min－1;柱溫:35℃;流動相:甲醇－乙腈－0.2%H3PO4水溶液=20 ∶13 ∶67;進樣量:20 μl。

2.4 血漿阿司匹林酯酶活性評價 以CSA/(CASA+CSA)值表示阿司匹林酯酶的活性，以(實驗組酶活性－對照組酶活性)/對照組酶活性評價阿司匹林酯酶活性變化。

3 結果

3.1 方法專屬性 在以上色譜條件下，阿司匹林、非那西丁(內標)和水楊酸的保留時間分別為6.38，8.13，10.23 min，峰形良好，分離度 R≥1.5，且內源性物質及其他成分對測定無干擾，見Fig 1。

3.2 線性關系考察 取阿司匹林和水楊酸對照品儲備液適量，分別用0.01 mol·L－1的HCl和甲醇稀釋至不同濃度，分別精密移取10 μl阿司匹林和水楊酸標準溶液于0.98 ml培養體系中(含0.88 ml Tris溶液和0.1 ml血漿)，使阿司匹林和水楊酸在培養體系中總體積為1 ml，其終濃度分別為6、4、2、1、0.8、0.3、0.06 mg·L－1和 6.24、3.12、1.56、0.78、0.39、0.13、0.078 mg·L－1。從“加入 20 μl非那西丁內標溶液”起，按2.2項下方法處理樣品，進行HPLC分析。以阿司匹林與內標的峰面積之比(Y)為縱坐標，以阿司匹林在培養體系中的最終濃度(X)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程=0.510 9X－0.019 5(r=0.999 7)，最低定量限為0.06 mg·L－1。以水楊酸與內標的峰面積之比(Y)為縱坐標，以水楊酸在培養體系中的最終濃度(X)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程=1.138 7X+0.071 8(r=0.999 6)，最低定量限為 0.078 mg·L－1。

3.3 精密度試驗 取阿司匹林和水楊酸對照品儲備液適量，用相應溶劑分別稀釋成低、中、高3種不同濃度的質控樣品，分別精密移取10 μl阿司匹林和水楊酸質控樣品于0.98 ml培養體系中(含0.88 ml Tris溶液和0.1 ml血漿)，使最終的總體積為1 ml，使阿司匹林在培養體系中最終質量濃度分別為0.15、1、4 mg·L－1，水楊酸在培養體系中最終質量濃度分別為0.13、0.78、3.12 mg·L－1。從上述“加入20 μl非那西丁內標溶液”起按2.2項下方法處理樣品，進行HPLC分析，根據隨行標準曲線求得藥物濃度，日內測定5次，日間測定5天。阿司匹林和水楊酸的日內和日間精密度見Tab 1。

Tab 1Precision of aspirin and salicylic acid(±s，n=5)

Tab 1Precision of aspirin and salicylic acid(±s，n=5)

Reference substance Spiked C/mg·L－1 Intra-day precision Measured C/mg·L－1RSD/%Inter-day precision Measured C/mg·L－1RSD/%ASA 0.15 0.16 ±0.006 3.86 0.16 ±0.012 7.50 1 0.98 ±0.044 4.61 0.97 ±0.046 4.74 4 4.01 ±0.382 9.54 3.98 ±0.211 5.30 0.13 0.14 ±0.007 5.00 0.13 ±0.006 4.62 SA 0.78 0.79 ±0.041 5.11 0.79 ±0.053 6.71 3.12 3.47 ±0.241 6.95 3.23 ±0.221 6.84

Fig 1 HPLC chromatograms of the aspirin esterase activity

3.4 回收率試驗 分別在加入100 μl空白血漿和不加空白血漿的培養液中按培養體系最終質量濃度0.13、0.78、3.12 mg·L－1加入 10 μl水楊酸，按0.15、1、4 mg·L－1加入 10 μl阿司匹林，并最終用Tris液補足至1 ml，混勻后，從“加入20 μl非那西丁內標溶液”起，按“2.2”項下方法處理樣品，進行HPLC分析，將兩組峰面積相比，計算相應的提取回收率，每個濃度分別測定5次，結果見 Tab 2。由Tab 2可見阿司匹林和水楊酸的提取回收率符合要求。

Tab 2 Extraction recovery of aspirin and salicylic acid( ± s，n=5)

Tab 2 Extraction recovery of aspirin and salicylic acid( ± s，n=5)

Reference substance Spiked C/mg·L－1 Extraction recovery/%RSD/%ASA 0.15 95.5 ±2.2 3.45 1 96.5 ±1.7 4.34 4 96.2 ±3.2 4.24 SA 0.13 92.3 ±4.3 5.34 0.78 97.6 ±3.3 4.28 3.12 98.7 ±3.2 4.82

3.5 綠原酸及其同分異構體對阿司匹林酯酶活性的影響 實驗組設立各單體成分低、中、高3個濃度(終濃度為 5、10、100 mg·L－1)，對照組加入等量的溶媒(甲醇)，按“2.2”項下條件進行體外培養，每個單體成分每個濃度平行做5份，結果見Tab 3。

Tab 3 Changes of aspirin esterase activity in the presence or absence of chlorogenic acid and its isomers(±s，n=5)

Tab 3 Changes of aspirin esterase activity in the presence or absence of chlorogenic acid and its isomers(±s，n=5)

#changes of enzyme activity=(enzyme activity of experimental group-enzyme activity of control group)/enzyme activity of control group

Compound Name Final concentration/mg·L－1 Enzyme activity CSA/(CASA+CSA )Control Experimental Changes of enzyme activity#/%P Chlorogenic 100 0.276 ±0.002 0.272 ±0.002 －1.45 0.111 acid 10 0.276 ±0.002 0.277 ±0.004 +0.36 0.997 5 0.276 ±0.002 0.285 ±0.002 +3.26 0.135 Cryptochlorogenic 100 0.309 ±0.005 0.309 ±0.003 0 0.629 acid 10 0.309 ±0.005 0.325 ±0.003 +5.18 0.144 5 0.309 ±0.005 0.332 ±0.004 +7.44 0.196 Neochlorogenic 100 0.309 ±0.005 0.325 ±0.001 +5.18 0.133 acid 10 0.309 ±0.005 0.326 ±0.005 +5.50 0.236 5 0.309 ±0.005 0.334 ±0.004 +8.09 0.107

4 討論

4.1 阿司匹林酯酶體外培養體系的優化 因人全血更接近人體內環境，本研究剛開始以人的全血作為阿司匹林酯酶的來源，且全血中酯酶的活性高于血漿中酯酶活性，但新鮮全血獲取難度大且難以保存，同時難以保證整個實驗中使用的全血來源基本相同且差異性較小。故最終選擇易獲取、易保存、較穩定的人混合血漿代替全血作為酯酶來源。

本研究在參考相關文獻的基礎上，進一步優化了阿司匹林酯酶的體外培養體系，降低了血漿及Tris液的體積，使整個培養體系的體積為1 ml。培養體系體積減少，一方面可節約人血漿和Tris液的使用量;另一方面體積減小可適當提高酯酶水解阿司匹林產生的水楊酸濃度，這樣可降低對儀器靈敏度的要求，并且可提高分析的準確度。

將10 μl濃度為120 g·L－1的阿司匹林加入含有100 μl血漿的總體積為1 ml Tris培養液中(A組)，發現A組中阿司匹林含量減少30%;同時將10 μl濃度為 120 g·L－1的阿司匹林加入不含有100 μl血漿的總體積為1 ml Tris培養液中(B組)，發現B組中阿司匹林含量減少3%，B組中阿司匹林的自然水解對實驗結果的影響可以忽略不計，說明該培養體系切實可行。

4.2 綠原酸及其同分異構體對酯酶活性的影響

在本實驗濃度下，發現綠原酸及其同分異構體對酯酶活性均沒有明顯影響，甚至還出現微弱的誘導作用。同時，本實驗還可以看出，以上化合物對阿司匹林酯酶的作用存在劑量依賴性，即隨著化合物濃度降低，該化合物對酯酶的抑制作用逐步減弱或誘導作用逐步增強。

從阿司匹林酯酶代謝途徑來看，綠原酸及其同分異構體不影響阿司匹林的代謝，可以推測綠原酸及其同分異構體成分與阿司匹林發生代謝性相互作用的可能性較小，為臨床合理用藥提供一定的理論依據。

4.3 關于本研究的進一步探索 綠原酸與隱綠原酸、新綠原酸結構相似，互為同分異構體，但從Tab 3可以看出3個化合物對酯酶活性的影響還是有一定差異的，這說明化合物結構的微小改變可能影響到阿司匹林酯酶的活性。接下來，本研究將深入探索其他咖啡酰奎寧酸類成分對酯酶活性的影響，并運用其他實驗方法進一步評價該類化合物與阿司匹林臨床合用的安全性。

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