女貞子治療去卵巢大鼠骨質疏松的實驗研究

程 敏，王慶偉，劉雪英，鄧雅婷，賈 朝

(1.商洛學院生物醫藥工程系，陜西商洛 726000;2.第四軍醫大學，陜西西安 710032)

女貞子為木犀科女貞屬植物女貞(Ligustrum lucidumAit.又名大葉女貞)的成熟果實，其性味甘苦、涼，入肝、腎經，具有滋補肝腎、明目烏發之功效，用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發早白、目暗不明［1］等癥。女貞子中所含的齊墩果酸含量較高，而熊果酸被證實有抗骨質疏松的活性。女貞子醇提物能明顯提高去卵巢(OVX)大鼠骨無機質、骨鈣含量，提高鈣平衡及鈣吸收率［2-4］。體外實驗表明，蒸女貞子經過水提醇沉所得的提取物可以明顯促進成骨細胞的增殖和分化［5］。本研究采用去卵巢大鼠骨質疏松模型，研究女貞子治療骨質疏松的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品及配制 戊巴比妥鈉(Bioszune美國)，戊酸雌二醇(北京雙鶴藥業股份有限公司)，ALP、BALP酶聯免疫檢測試劑盒(北京華英生物技術研究所)，OCN、DPD ELISA檢測試劑盒(Quidel美國)。女貞子藥材購自西安中藥飲片廠，經陜西省生物醫藥重點實驗室孫文基教授鑒定為Ligustrum lucidumAit.(Oleaceae)的果實。女貞子提取液制備過程如下:取1 000 g女貞子粉碎成粗粉，10倍量75%乙醇浸泡1 h，水浴80℃回流提取2 h，2次，合并提取液，減壓濃縮回收乙醇，最終將提取液濃縮至1 000 ml(每1 ml相當于原藥材1 g)，4℃儲藏備用。采用反相高效液相色譜法［Kromasil-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流動相:(甲醇-乙腈(50 ∶50):0.1%H3PO4=(85 ∶15)，檢測波長205 nm，柱溫25℃，流速1 ml·min-1］對女貞子粗提物中齊墩果酸和熊果酸進行檢測，結果兩者含量分別為0.83%、0.21%。戊酸雌二醇用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液配制成40 mg·L-1的混懸液，女貞子粗提液用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液配制成0.45 mg·L-1.以上藥液每次配制1周藥量，4℃保存，每天灌胃前恢復至室溫，搖勻。

1.2 主要儀器 7170A型全自動生化分析儀(HITACHI日本)、Lunar ProdigyAdvance DXA型骨密度儀(GE美國)。

1.3 實驗動物 60只♀未經產3月齡SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質量(230±20)g，購自第四軍醫大學實驗動物中心。動物合格證號:SCXK(軍)2007-007。飼養條件:開放式動物飼養室，室溫控制在(23±2)℃，濕度(60±5)%，自然光源，標準營養顆粒飼料喂養(購自第四軍醫大學實驗動物中心，含鈣0.9%，磷0.7%)，自由飲水。

1.4 骨質疏松模型制備及分組給藥 將大鼠隨機分為2組，偽手術組10只、其余50只為去卵巢組。大鼠在實驗室適應性飼養7 d后，偽手術組大鼠行假手術，其余大鼠行雙側卵巢去除術［6］。50只大鼠去卵巢手術4周后隨機分為5組。即，戊酸雌二醇組(EV，0.4 mg·kg-1·d-1)，女貞子大劑量組(FLL-H，9 g·kg-1·d-1)，女貞子中劑量組(FLLM，4.5·kg-1·d-1)，女貞子小劑量組(FLL-L，2.25 g·kg-1·d-1)和模型組(OVX)。手術1個月后，各組每天上午灌胃給藥1次，偽手術組(Sham)和OVX組也同時給予同體積0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液，各組每周給藥6 d，共給藥26周，每周稱量體重1次。

各組大鼠連續給藥26周后收取尿液和血液。采用7170A型全自動生化分析儀及相應試劑盒測定血鈣(S-Ca)、血磷(S-P)、尿鈣(U-Ca)、尿磷(UP)和尿鉻(U-Cr)的含量;ELISA試劑盒測定血清堿性磷酸酶(ALP)、血清骨特異性堿性磷酸酶(BALP)含量、骨鈣素(OCN)含量、尿液中脫氧吡啶啉(DPD)含量;采用骨密度儀對大鼠全身骨骼進行掃描，掃描時采用小動物模式。掃描完畢后在GE公司配套的encore2006骨密度儀工作站上采用手動圈出興趣區域自定義ROI(range of interests，ROI)的模式對各組大鼠的股骨、脛骨、第4椎骨的BMD(bone mineral density，BMD)進行分析［7］。動物處死后完整取下心、肝、脾、肺、腎、胸腺、腦、子宮進行稱重，并用HE染色法進行子宮病理切片。

Fig 1 Effects of 26-week treatment with EV，FLL-H，FLL-M，FLL-L on body weight，uterus and organ weight of ovariectomized(OVX)rats(±s)

2 結果

2.1 對去卵巢大鼠體重、子宮、臟器指數的影響如Fig 1 A所示，各組動物手術前體質量未見顯著性差異。從術后第10周開始，各去卵巢組大鼠與偽手術組大鼠相比體重增加(P＜0.05)。EV和FLL-M治療組均能對抗由于去卵巢導致的大鼠體重增加(P＜0.01)，FLL-H和FLL-L治療組從第10周開始也顯示出能明顯對抗去卵巢大鼠的體重增長，并且此作用一直延續到實驗結束，但是與OVX組相比差異無統計學意義。

結合各組大鼠子宮病理切片(Fig 2)和子宮系數Fig 1 B結果所示，連續給予雌激素26周后致使子宮肌細胞增生肥大、肌層增厚，促進子宮內膜腺體及間質增生，子宮重量明顯增加。EV組大鼠子宮增生明顯，OVX組大鼠子宮明顯萎縮，各摘卵巢組大鼠子宮均小于Sham組，而FLL各劑量組大鼠子宮內膜增生不明顯，接近OVX組，顯示了摘卵巢手術的成功。對各組大鼠子宮系數與Sham組相比，OVX組大鼠的子宮系數降低(P＜0.01)，EV組能明顯對抗這一現象，而FLL各劑量組對OVX組大鼠子宮系數均無影響。如Fig1 C中各組大鼠臟器指數所示，與Sham組相比，EV組、FLL各劑量組連續治療26周對去卵巢大鼠心、肝、脾、肺、腎、胸腺及腦的臟器指數沒有影響，解剖動物的過程中各組臟器也未見異常。

Fig 2 Hematoxylin and eosin-stained sections of rat uteri obtained from(A)Sham control，(B)OVX control，(C)EV，(D)FLL-H，(E)FLL-M and(F)FLL-L.(×50)

2.2 對去卵巢大鼠血液及尿液中鈣、磷含量的影響血液及尿液中鈣、磷檢測結果(Tab 1)顯示:去卵巢26周后，與偽手術組相比，OVX組大鼠的S-Ca、S-P降低(P＜0.01)，U-Ca、U-P升高(P＜0.01);EV治療對S-Ca、S-P降低和U-Ca、U-P升高均有明顯的逆轉作用(P＜0.01);FLL-H和FLL-M組連續治療26周對OVX所致大鼠的 S-Ca、S-P、U-Ca、U-P變化均產生了影響(P＜0.05)，其中FLL-M組尤為明顯(P＜0.01);FLL-L組連續治療26周對OVX所致大鼠的U-Ca、U-P升高有明顯抑制作用(P＜0.05)，雖然能同時升高S-Ca和S-P水平，但差異無統計學意義。

Tab 1 Effects of 26-week treatment with EV，FLL-H，FLL-M，FLL-L on biochemical parameters in serum and urine of ovariectomized(OVX)rats

2.3 對去卵巢大鼠骨轉換指標(ALP、BALP、OCN、DPD)的 影 響 血 清 中 ALP［8］、BALP［9］、OCN［10］被廣泛認為是評價骨形成的生化指標，尿中DPD是反映骨吸收的生化指標［11-12］。骨轉換指標檢測結果如Fig 3中所示:與偽手術組相比，OVX對大鼠血清中反應骨轉化的所有指標 ALP、BALP、OCN和DPD均產生了影響(P＜0.01);EV連續治療26周對OVX所致大鼠血清ALP、BALP、OCN和DPD的升高具有明顯逆轉作用(P＜0.01);FLL各劑量組連續治療26周對OVX所致大鼠骨轉換的所有指標具有明顯逆轉作用(P＜0.05)。

2.4 對去卵巢大鼠股骨、第4椎骨及脛骨骨密度的影響 骨密度儀檢測大鼠BMD結果如Fig 4顯示，去卵巢26周后，與偽手術組相比，OVX組大鼠的股骨、第4椎骨及脛骨的骨密度值均發生降低(P＜0.01);EV連續治療26周能抑制OVX誘導的大鼠股骨、第4椎骨及脛骨BMD的下降(P＜0.01);FLL-M組連續治療26周能升高大鼠股骨、第4椎骨及脛骨BMD(P＜0.01)，具有與雌激素相類似的功效，FLL-H、FLL-L能升高大鼠股骨BMD(P＜0.05)，而對大鼠第4椎骨及脛骨BMD無影響。

Fig 3 Effects of 26-week treatment with EV，FLL-H，FLL-M and FLL-L on bone turnover markers in ovariectomized(OVX)rats( ± s)

Fig 4 Effects of 26-week treatment with EV，FLL-H，FLL-M and FLL-L on the BMD in femur，4th lumbar vertebra and tibia of ovariectomized(OVX)rats by DXA(±s)

3 討論

大鼠去卵巢后雌激素分泌減少，子宮萎縮甚至功能消失，而雌激素缺乏是導致骨質疏松的最主要因素之一［13］。實驗研究發現，大鼠去卵巢26周后，體重明顯升高，子宮明顯萎縮，戊酸雌二醇治療組能明顯對抗這一現象，與先前報道的雌激素缺乏可以導致體重增加、子宮萎縮，而補充雌激素能明顯改善這一現象相一致［14-15］。女貞子中劑量組連續給藥26周能明顯降低去卵巢大鼠的體重增長，這可能與其能促進雌激素分泌，從而促進前體細胞向成骨細胞分化，同時阻止前體細胞向脂肪細胞分化，并調節動物體內能量代謝有關［16］。

堿性磷酸酶(ALP)和骨特異性堿性磷酸酶(BALP)都是參與骨代謝的重要蛋白質，他們與血清中骨鈣素(OCN)都是反映成骨細胞活性的主要指標。在骨吸收發生時，骨的Ⅰ型膠原會分解出脫氧吡啶啉(DPD)，釋放到血液中，并且以原形直接經腎臟排出，是目前反映骨吸收最特異、最先進的指標之一［17-19］。因此，測定血尿中鈣磷物質的含量及測定代表骨轉換指標的BALP、ALP、OCN和DPD含量對于了解骨代謝情況具有重要意義。本實驗結果顯示，去卵巢26周后，各組大鼠血中鈣磷水平明顯下降，尿鈣尿磷排泄明顯增加，說明OVX大鼠處于負鈣平衡狀態，體內鈣流失增加，吸收降低。本實驗中觀察到，去卵巢組骨形成、骨吸收生化指標(ALP、BALP、OCN、DPD)比對照組都明顯升高，說明OVX大鼠骨形成、骨吸收都異常增強，這一現象與臨床上絕經后婦女呈現高骨轉換狀態相符合。戊酸雌二醇、女貞子中劑量有助于抑制去卵巢大鼠的高骨轉換狀態，能增加鈣磷吸收率，降低骨丟失，使骨重建恢復平衡狀態，這與女貞子中劑量組連續治療26周能升高大鼠股骨、第4椎骨及脛骨的骨密度相一致。總之，女貞子對大鼠去卵巢所致的骨質疏松癥有良好的治療效果，可以防止雌激素減少引起的體重增加，降低骨轉換率，增加大鼠股骨、第4椎骨、脛骨的骨密度，并且在治療OP的同時，長期用藥無明顯的毒副作用。

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