回醫烙灸法對大鼠實驗性腰椎間盤退變MMP-3表達的影響

許建峰，林瑞珠，牛子瞻，張躍全，武永利，王英絮

（寧夏醫科大學總醫院，寧夏 銀川 750004）

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IDD）是椎間盤突出、椎管狹窄、慢性下腰痛等疾病的主要原因之一，其發生、發展有多種炎性細胞和基質金屬蛋白酶的參與。尋找有效的治療方法和途徑干預炎性細胞和金屬蛋白酶，延緩或抑制椎間盤退變的發生、發展是研究的難點［1］。目前現代醫學尚無有效方法防治椎間盤退變，基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）在退變過程中起著重要的作用已經成為研究的熱點。回醫烙灸療法具有補腎強督、強筋健骨的作用，在治療椎間盤退變方面已取得良好的療效［2］。本實驗采用回醫烙灸療法治療大鼠椎間盤退變，觀察大鼠的椎間盤組織Miyamoto分級變化，并通過免疫組織化學方法檢測MMP-3變化，為回醫烙灸療法治療腰椎間盤退變提供理論和實驗根據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康2個月齡清潔級SD大鼠 45 只，雄性，體重（450±20）g，寧夏醫科大學總醫院動物中心提供，動物合格證號：SCKX（寧）2011－0013。將大鼠隨機分為模型組、假手術組和回醫烙灸組3組，每組各15只。

1.2 藥品及試劑 一抗為MMP-3多克隆抗體，二抗羊多克隆抗體（Santa Cruz公司），一抗按1∶75稀釋；免疫組化SABC試劑盒、PBS緩沖液、枸椽酸鹽緩沖液購于北京博奧生物工程有限公司；DAB顯色劑購于Gibco公司；6.5%的水合氯醛購于寧夏醫科大學總醫院制劑中心；灸法所用艾絨購于寧夏醫藥公司［豫鄭食藥監械（準）字2012第1270003號］；熒光顯微鏡（型號Nikon，日本Nikon公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物造模 大鼠稱重，術前X線片定位，以6.5%的水合氯醛0.055 mL／kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后腹部剪毛，清潔，仰臥位，固定四肢，碘伏消毒鋪巾。取右側旁正中切口，長約1.5～2.0 cm，遠端略過髂嵴2～3 mm。將腸管及大網膜用濕紗布向頭側、對側推移，暴露腹后壁，剪開腹后膜，保護好下腔靜脈，將腰大肌從脊柱附著點上節段性剝離（髂嵴平對L6椎體或5～6椎間盤），暴露5～6椎間盤，利用21G微量穿刺針對以上椎間盤行穿刺，針刺角度與椎間盤矢狀面呈0°～60°，平行于軟骨終板進針，穿刺深度為2.3 mm，針刺貫穿整個纖維環全層。針刺成功后，縫合腹膜層、肌層，關閉皮膚。假手術組SD大鼠僅切開皮膚后即縫合。

1.3.2 治療方法 ①回醫烙灸組：造模1個月后開始，將大鼠固定在用300 mL塑料飲料瓶自制的固定器上，特制的鐵器灸具放置在大鼠命門到腰俞的督脈及雙腎俞穴處，然后放上艾絨10 g在灸槽點燃，發熱鐵器灸具可使局部皮膚發紅發泡，5 d 1次，每次20 min，治療2個月后取材。② 模型組、假手術組：造模1個月后開始，不予任何干預手段，每5 d在固定器上固定20 min，治療2個月后取材。

1.3.3 取材 在大鼠治療2個月后將各組大鼠腹腔麻醉處死，取出完整的L5～6椎間盤組織，將標本置入10%甲醛液固定48 h，持續流水沖洗1 h，梯度乙醇依次脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，待用。

1.4 形態學觀察 3組大鼠椎間盤組織石蠟包埋塊切片，組織切片平均厚度約4 μm，二甲苯脫蠟，梯度乙醇入水，流水沖洗片刻，蘇木精液及伊紅液染色，進行光鏡觀察。按Miyamoto分級標準將椎間盤分為1～5 級，分別計為 1、2、3、4、5 分。

1.5 免疫組織化學染色 石蠟切片脫蠟至水，加入3%H2O2消除內源性過氧化物酶活性，PBS沖洗 3次，浸入0.01 mol／L枸椽酸鹽緩沖液并置于高壓鍋內，15 min行抗原修復，室溫冷卻后PBS漂洗3次；5%BSA室溫封閉20 min，阻斷內源性生物素，滴加一抗（1∶50 稀釋 MMP-3），4℃過夜。PBS漂洗 3次，滴加生物素標記的二抗，室溫、濕盒內孵育30 min，再次PBS漂洗3次；滴加DAB顯色劑，顯色適度后終止反應；蘇木素復染、脫水、透明，封片。

1.6 圖像分析及處理 以熒光纖維鏡觀察陽性部位，細胞中成棕黃或棕褐色為MMP-3染色。每個組織標本隨機選取不重疊的10個觀察視野，用LeicaQ500MC圖像系統進行MMP-3表達的陽性細胞進行定量測試。根據不同染色部位的灰度值，自動計算出陽性細胞的平均灰度。

1.7 統計學處理 所得數據采用SPSS 11.0統計軟件包進行分析。計量資料呈正態分布的用表示，組間治療后呈正態分布的計量資料采用兩樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組形態分級評分觀察 見表1。

表1 3組對大鼠實驗性退變腰椎間盤Miyamoto 分級標準（） 分

表1 3組對大鼠實驗性退變腰椎間盤Miyamoto 分級標準（） 分

注：與模型組比較，1） P＜0.01；與假手術組比較，2） P＜0.05。

組 別回醫烙灸組假手術組模型組形態學分級評分2.31±0.481）2）1.91±0.531）3.02±0.71 n 15 15 15

2.2 3組免疫組織化學檢測 見表2。

表2 3組對大鼠實驗性退變腰椎間盤中 MMP-3 表達的影響（）

表2 3組對大鼠實驗性退變腰椎間盤中 MMP-3 表達的影響（）

注：與模型組比較，1） P＜0.05。

平均光密度值（MOD）0.19±0.011）0.16±0.021）0.36±0.03組 別回醫烙灸組假手術組模型組n 15 15 15

3 討 論

隨著社會人口老齡化進程的加快，IDD將成為前所未有的公共衛生問題，輕者引起慢性頸臂痛或腰腿痛，重者引起神經功能障礙甚至截癱［3］。所以，目前對椎間盤退變內源性機制和防治措施等方面進行縱深研究具有迫切性和重要性［4］。

椎間盤退變引發多種復雜的生物學效應：①促進椎間盤細胞凋亡；② 影響椎間盤基質合成；③ 促進基質金屬蛋白合成及基質破壞；④通過誘導IL-1、IL-6等致炎因子的產生而使椎間盤的內環境產生惡性循環［5］。然而在這些的變化中，椎間盤細胞外基質的變化是椎間盤退變及生物力學改變的至關重要的因素。研究表明：MMPs是分解細胞外基質的蛋白酶中最重要的一類，其中MMP-3在細胞外基質的降解中起關鍵的作用［6］。MMP-3不僅能降解蛋白多糖和糖蛋白，還能分解多種類型的膠原纖維，從而加劇椎間盤的退變和椎間盤組織水分的丟失。椎間盤的退變是遺傳、機械、物理、生物學和炎癥刺激等諸多因素綜合作用的結果，這些因素組成了一個極其龐大復雜的網絡，而MMP-3是這個網絡中的比較重要一環，在椎間盤退變過程中起到舉足輕重的作用，同時MMP-3也受到諸多因素的調控和影響。因此，抑制MMP-3的活性，從而調控其對細胞外基質蛋白多糖和膠原纖維的降解作用以減緩椎間盤退變，這是研究減緩和治療椎間盤退變的一個關鍵點和重要作用靶點［7］。

腰椎間盤退變屬中醫和回醫的 “痹病”、“腰痛”范疇。病機為肝腎不足，筋骨失養。回醫認為本病主要由肝腎不足導致的腰部四液、四性失衡所致。回醫烙灸療法是用烙藥或鐵器燒灼直接烙燙于病痛或患處的體表部位，使得局部皮膚發紅發泡，促使機體康復的一種治療方法，治療需達到“灸時須使皮破”的效果。這種獨具特色的灸法，是祖國醫學“化膿灸”的發展與深化。回醫烙灸療法排出患處異常體液及代謝衰敗過程中的四液病理產物，從而促進四性、四液平衡，最終達到人體所需要的體液平衡和陰陽平衡。回醫烙灸療法風格獨特，對疾病的治療可達到“病根盡去”的目的［2］。回醫烙灸療法較中醫化膿灸刺激面大，治療溫度可以根據鐵制灸具灸槽中艾絨的多少來調節，鐵制灸具有傳熱快、操作簡單等優點，臨床上深受患者的喜愛。

烙灸療法有補腎強督、強筋健骨作用，同時通過起泡化膿可以排出腰椎局部寒、濕、瘀血等病理產物，從而達到扶正驅邪的目的。通過本實驗研究表明：回醫烙灸法可明顯減少大鼠退變腰椎間盤組織中MMP-3的陽性表達的強度。我們通過前期研究發現化膿灸可以顯著降低椎間盤退變的IL-6，有部分學者認為它與椎間盤退變程度呈正相關，下調基質蛋白的表達，上調 MMPs和 ADAMTs的轉錄［8］。回醫烙灸法通過對炎癥因子的介導，達到降低MMP-3的表達，進一步減少了軟骨細胞的凋亡，減少細胞外基質中的蛋白多糖及II型膠原纖維等的降解，促使椎間盤退變延緩，形態學評分下降。因此有必要對回醫烙灸治療椎間盤退變進行更加深入的機制探討，為其治療椎間盤退變提供理論和實驗根據。

［1］肖學軍，趙衛東.椎間盤退變與椎間盤軟骨終板退變［J］.中國醫藥指南，2011，9（11）：34-35.

［2］喬建榮，粱穎，靳萱，等.《回回藥方》烙灸療法探析［J］.寧夏醫科大學學報，2011，33（2）：101-102.

［3］PING CHUNG LEUNG.Importance of the relationship between BMD and disc degeneration in the lumbar spine in the elderly［J］.Aging health，2010，6（4）：465-467.

［4］楊勇，姜建元，呂飛舟，等.骨髓間充質干細胞治療椎間盤退變研究進展［J］.國際骨科學雜志，2012，33（3）：181-183.

［5］文天用，李放，葉超群.p38 MAPK信號轉導通路與椎間盤退變［J］.中國康復理論與實踐，2010，16（9）：841-842.

［6］陳德勝，李燕，郭鳳英，等.枸杞多糖對實驗性退變腰椎間盤中基質金屬蛋白酶-3表達的影響［J］.寧夏醫學雜志，2012，34（4）：303-304.

［7］ELLMAN M B，KIM J S，AN H S，et al.Toll-like receptor adaptor signaling molecule MyD88 on intervertebral disk homeostasis：in vitro，ex vivo studies［J］.Gene，2012，505（2）：283-290.

［8］SUZUKI M，HASHIZUME M，YOSHIDA H，et al.IL-6 and IL-1 synergistically enhanced the production of MMPs from synovial cells by up-regulating IL-6 production and IL-1 receptor I expression［J］.Cytokine ，2010，51（2）：178-183.