維甲酸誘導腭裂發生的過程中對TGF-β/Smad信號途徑的抑制作用

劉小轉，潘新娟，張 麗

腭裂是口腔頜面部最常見的先天性畸形之一。引起先天性腭裂發生的原因包括遺傳因素和環境因素,約20%腭裂歸因于遺傳因素, 80%以上原因未知[1]。維甲酸是維生素A的生物活性形式，在生物體的胚胎發育、器官形成，細胞增殖及分化和維持正常生理功能中起重要作用。然而，維甲酸也是一種常見致畸物，過量的維甲酸能導致腭裂的發生[2]。在眾多組織中維甲酸可以調控轉化生長因子 (transforming growth factor-β, TGF-β)亞型的表達，其中就包括胚胎的組織和細胞[3]。在細胞增殖和分化過程中，維甲酸對TGF-β信號途徑的調節作用至關重要[4]。TGF-β超家族是一類具有多種生物學活性的細胞因子, 是一種細胞生長的雙向調節因子。有研究顯示TGF-β亞型在腭發育過程中具有時空表達的特性[5]。在本次實驗中，建立由維甲酸誘導的昆明小鼠腭裂動物模型，并在此基礎上用免疫組化的方法檢測P-Smad在腭突發育過程中的表達情況，以探討維甲酸誘導腭裂發生的過程中對TGF-β/Smad信號途徑的影響，并分析其可能的致畸機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及標本制備選用昆明小鼠(由鄭州大學實驗動物中心提供)，8周齡左右，雌鼠體質量30 g以上，雄鼠體質量35 g以上。雌雄比例為3∶1，前1天晚8時同籠，第2天上午8時檢栓。將陰栓陽性的雌鼠記為妊娠0 d(gestation 0 day,GD0)。共得到孕鼠24只，隔離飼養，于GD10 d下午1時，24只孕鼠隨機分兩組：第1組為對照組，共12只；第2組為實驗組，共12只。實驗組管飼全反式維甲酸(購于Sigma公司) ，劑量為100 mg/kg，溶于0.2 mL玉米油中；對照組管飼等體積的玉米油。分別于妊娠12、13、14.5、15、15.5、16 d 6個時間點頸椎脫臼處死孕鼠，每組各2只，剖腹取胎鼠，截取胎鼠頭部。4%多聚甲醛固定6 h，梯度酒精脫水，頭喙部朝下， 常規石蠟包埋，5 μm 連續切片，60℃烤箱置8 h，用于HE染色和免疫組化研究。

1.2實驗藥品及試劑全反式維甲酸(美國Sigma公司)，P-Smad多克隆抗體(美國Chemicon/Upstate公司)，免疫組化試劑盒(北京中杉公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉公司)。

1.3HE染色實驗組與對照組包埋的組織標本做HE染色，光鏡下觀察腭突發育的動態過程。

1.4免疫組化染色采用ABC法，切片脫蠟至水，0.3%H2O2室溫下孵育10 min，正常羊血清孵育20 min，滴加兔抗鼠P-smad 2抗體(1∶800)， 4℃濕盒過夜，37℃復溫1 h，滴加生物素化二抗，37℃孵育30 min，滴加酶結合物，37℃孵育30 min，DAB顯微鏡下控制顯色5～10 min。上述各步之后均用0.01 mol/L PBS振洗3次，每次5 min。用0.01 mol/LPBS緩沖液代替一抗染色的切片作陰性對照，蘇木精復染，常規脫水，二甲苯透明，封片。

2 結果

2.1小鼠上腭大體標本的形態觀察腭裂畸形在肉眼下較難觀察，需借助放大鏡或解剖顯微鏡。鏡下可見對照組E16 d小鼠上腭融合完全， 有明顯的腭

皺。實驗組E16 d小鼠腭裂均為正中裂，全層裂開，兩側腭突及鼻中隔均未相連(見圖1)。

A：對照組，B：實驗組

2.2光學顯微鏡觀察小鼠腭部發育的動態變化對照組：E12 d 舌體位置很高，側腭突剛剛從原始口腔內的上頜突中長出。E13 d舌體位置接近鼻中隔，腭突在舌側垂直生長。E14.5 d舌體下降，腭突上抬，達到舌體之上，處于水平狀態，雙側腭突逐漸接觸，形成中縫。E15 d～E15.5 d兩側腭突接觸后并融合，中縫逐漸消失。至E16 d所有標本兩側腭突完全融合，腭間質貫通(見圖2)。實驗組：E12 d～E13 d在腭突的剛長出到垂直生長期，舌體及腭突的位置、形態與對照組無明顯差異。E14.5 d當腭突上抬時，出現腭突的上抬延遲。E15 d～E16 d兩側腭突未接觸，形態較對照組小，形成腭裂(見圖3)。

A：E12 d，B: E13 d，C：E14.5 d，D：E15 d，E：E15.5 d，F：E16 d

A：E12 d，B: E13 d，C：E14.5 d，D：E15 d，E：E15.5 d，F：E16 d

2.3維甲酸對TGF-β/Smad信號途徑的抑制作用對照組：在E12 d～E13 d腭突的剛長出到垂直生長期，腭突上皮內無P-Smad2陽性表達。在E14 d～E14.5 d腭突上抬至水平位置階段，腭突上皮中出現P-Smad2陽性表達，提示在正常腭發育過程中TGF-β/Smad信號被激活。在垂直生長期和融合后期，腭突上皮內無P-Smad2陽性表達。實驗組：自始至終腭突的上皮中均檢測不到P-Smad2陽性表達(見圖4)。

DAB顯色，蘇木素復染，棕褐色為陽性

3 討論

脊椎動物的腭的發育過程是非常相似的。左右腭突移向舌面上方，并逐漸接觸，接觸處的中嵴上皮組織變厚形成橋粒，把二者連在一起，并形成中嵴上皮縫，這些中縫上皮在組織的連接匯合處進行上皮—間質轉化，最終完全融合[6]。腭突中嵴上皮細胞是一種在融合前位于腭突近中線邊緣的外胚層細胞，與腭裂發生有著密切的關系。最初的MEE細胞分為兩層，當腭突上抬并向水平方向生長后，表層MEE細胞開始脫落，至兩側腭突接觸前完全脫去，MEE細胞變為單層細胞[7]。在兩側的上皮發生接觸前，細胞的DNA已經停止合成24～36 h，當上皮層的基地細胞暴露時，上皮層內的細胞發生生理性死亡，表面的細胞開始脫落，細胞黏著形成僅含有兩層基底細胞的上皮縫，最后發生融合，多數學者認為MEE細胞的最終轉歸形式包括兩種：一是退化或死亡；二是上皮—間質轉化。

腭突的融合與中嵴上皮細胞復雜變化緊密相關，由很多生長因子調控，其中包括TGF-β。哺乳動物TGF-β共有3種: TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，這3種亞型均參與腭發育的眾多生物過程，例如細胞的遷移、上皮間質間的轉化、細胞外基質的合成與沉積、基底膜的退化、細胞的增殖和凋亡[8]等。在腭突融合的過程中，TGF-β及其下游信號分子Smad2/ Smad3具有時空表達的特性。TGF-β家族成員通過激活一系列的絲氨酸酶和蘇氨酸酶起作用。一個激活的TGF-β配體由細胞膜錨定的TβRIII遞呈給跨膜信號的受體TβRI和TβRII、TβRI和TβRII隨后又激活細胞內的Smad蛋白，受體調控的Smad蛋白具有高度的同源性，通過磷酸化激活的Smad2和Smad3與通路中的共調控蛋白Smad4形成一聯合體，一起轉入細胞核內，在細胞核內調控TGF-β效應基因的轉錄[9]。

10年前，TGF-β3-/-突變型小鼠腭裂的發生，使人們發現TGF-β3在腭裂發育過程中起著重要的作用[10]。在這些突變體中，腭裂的發生是由兩側腭突的上皮無法融合所導致。不久人們又發現外源性TGF-β3可以促使TGF-β3-/-突變型小雞上腭的融合，這個過程主要是通過MEE細胞的上皮—間質轉化完成的[11]。在腭突融合過程中，Smad2的磷酸化在空間上局限于腭突的中嵴上皮細胞，在時間上也與中嵴上皮的退化、消失密切相關。在TGF-β3-/-突變型胎鼠腭突中嵴上皮中間測不到磷酸化Smad2的表達，然而，如果加入外源性磷酸化Smad2，則可以挽救TGF-β3-/-突變型胎鼠腭裂的發生[12]。另外，Smad2基因敲除小鼠不能形成中胚層，胚胎在原腸胚形成過程中或者形成后就已經死亡[13]，因此很難明確地研究Smad2在腭發育過程中的具體作用。然而，Smad3基因敲除小鼠，出生時無明顯的缺陷，而且存活良好。由此可見，Smad3在腭發育過程中并不起作用，在功能上可以由Smad2補償[14]。維甲酸是一種常見致畸物，過量的維甲酸能導致腭裂的發生。本研究結果顯示：在腭突融合過程中，維甲酸可以抑制Smad2的磷酸化從而抑制TGFβ/Smad信號途徑。由此可以推斷，維甲酸誘導腭裂的發生，與中嵴上皮細胞中TGFβ/Smad信號途徑的抑制密切相關。

參考文獻：

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