加味當歸補血湯對大鼠腦缺血再灌注損傷的神經保護作用研究*

高曉蘭，朱增強

(1.甘肅中醫學院人體解剖與組織胚胎學教研室，甘肅蘭州730000;2.蘭州石化總醫院腫瘤血液科，甘肅蘭州730060)

研究防止腦缺血再灌注后神經損傷的藥物，尋找有效的方法促進腦卒中后神經元的功能恢復，一直是相關生命學科研究的重要課題。缺血性腦卒中的主要病理過程是腦部的缺血再灌注損傷。海馬區對缺血缺氧比較敏感，腦缺血再灌注損傷可造成海馬區錐體細胞遲發性壞死［1］。腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)是新近發現的神經系統特異性攜氧蛋白，與腦內氧的運輸、貯備和利用密切相關［2］。當歸補血湯有補氣益血之功效，有研究表明加味當歸補血湯可促進心肌代謝，解除冠狀動脈痙攣，減輕心肌的缺血性損傷［3］。有關加味當歸補血湯對實驗動物腦缺血再灌注損傷的作用和機制研究并不多見。本實驗觀察了加味當歸補血湯對大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬各區NGB陽性神經元的表達和腦組織梗死體積的影響，以期從而探討加味當歸補血湯對大鼠腦缺血再灌注損傷后的神經保護作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

Wistar大鼠60只，雌雄不限，體質量22～280 g，由甘肅中醫學院實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(甘)2011－0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

加味當歸補血湯組方:黃芪100 g，黨參100 g，當歸20 g。藥物均購自蘭州德生堂大藥房，所有藥物先添加少量蒸餾水浸泡1 h，再分別加1 000 mL和500 mL蒸餾水煎煮2次，每次1 h，最后合并2次藥液，濾紙過濾、，浴鍋蒸發濃縮至濃度為1 g生藥/mL備用，使用時再加蒸餾水配制成所需濃度。200 g/L烏拉坦，上海化學試劑廠產品，批號110412;NGB多克隆抗體和相應標記二抗，購自Santa Cruz公司;濃縮型SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)免疫組化染色試劑盒(批號201012)、二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(批號 K12613B)以及 2，3，5－氮化三苯基四氮唑(Triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染色試劑盒(批號F20080102)，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。其他試劑由甘肅中醫學院醫學實驗中心病理實驗室提供。BI－2000型醫學圖像分析系統，成都泰盟科技有限公司提供;AO－82型輪轉式切片機，產地美國;FA2004N型電子分析天平，上海精科天平廠產品;Olympus CH－212型光學顯微鏡，日本Olympus公司產品;臺式離心機，金壇市恒豐儀器廠產品;PYX－PHS－B型隔水式電熱培養箱，上海躍進醫療器械廠產品。

1.3 模型的建立、分組與給藥

大鼠在實驗室環境適應性飼養7 d后，開始以線栓法［4］制備腦缺血再灌注損傷模型。大鼠術前禁食8～12 h后，以200 g/L烏拉坦(750μg/g)腹腔注射麻醉，仰臥固定于固定架上，頸部皮膚備皮、消毒，正中稍左側切口，分離皮下組織，在胸骨舌骨肌與胸鎖乳突肌之間找到大血管，觸摸有搏動感，即頸總動脈。分離左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，在距頸總動脈分叉處1 cm位置結扎左側頸外動脈，同時動脈夾夾閉左側頸總動脈，提起左側頸外動脈游離端使其與頸內動脈成一直線，于頸外動脈結扎處近心端約0.5 cm位置剪一小切口，以左側頸總動脈分叉處為標記，將一尼龍線經左側頸外動脈切口處緩慢向頸內動脈方向推進，推進18～20 mm感受到輕微阻力時即為阻斷了大腦中動脈。阻斷2 h后，撥出尼龍線，扎緊動脈殘端，縫合傷口，完成大鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立。假手術對照組除不插線外，其他過程同上。60只實驗大鼠中有15只或因手術麻醉、出血死亡、或不符合模型標準被棄。將余下45只隨機分為以下3組:假手術及生理鹽水灌胃對照組(A組)，局灶性腦缺血損傷再灌注及生理鹽水灌胃組(B組)，局灶性腦缺血再灌注損傷及加味當歸補血湯灌胃給藥組(C組)，每組15只。造模術后第2天起開始給藥，C組大鼠以加味當歸補血湯10 mg生藥/g體質量灌胃，A、B兩組大鼠以生理鹽水10μL/g體質量灌胃，每天2次，連續2周。

1.4 檢測指標

末次給藥后將各組大鼠斷頭取腦，置于40 g/L多聚甲醛固定液中12 h，常規石蠟包埋，取兩耳極連線前6 mm左右冠狀切面，切片厚7μm，4℃冰箱保存備用。

1.4.1 海馬各亞區及齒狀回NGB免疫反應及陽性細胞數

SABC免疫組織化學染色法檢測。石蠟切片常規脫蠟至水化，用1∶50過氧化氫－甲醇混合液(20 ℃)處理30 min，0.01 M PBS緩沖液漂洗3 次;將載玻片放入濕盒，滴加正常山羊血清封閉液，室溫(20℃)放置30 min，不洗;滴加NGB多克隆抗體，4℃冰箱過夜后，0.01 M PBS緩沖液洗滌3次;滴加兔抗大鼠IgG，室溫(20 ℃)孵育30 min，0.01 M PBS緩沖液洗滌3次;滴加SABC，室溫(20℃)孵育30 min，0.01 M PBS緩沖液洗滌3次;室溫下DAB顯色，鏡下控制反應時間，以NGB陽性神經元呈棕黃色、背景為淡黃色為度，蒸餾水洗滌;梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性塑膠封片后顯微鏡觀察大鼠海馬各亞區及齒狀回(dentate gyrus，DG)組織切片，取每張切片5個高倍視野，計算NGB免疫反應陽性細胞數。

1.4.2 腦組織梗死體積

以TTC染色法檢測。將大鼠斷頭取腦速凍后，取視交叉后方連續2 mm腦組織冠狀切片，放置于20 g/L的TTC染液中;于37℃恒溫孵育15 min，梗死區腦組織呈現灰白色，而正常腦組織呈現鮮紅色;將顯色后的腦組織切片放置于40 g/L多聚甲醛緩沖液中固定24 h;分離出梗死區腦組織，電子天平稱質量，然后以梗死區腦組織的質量占缺血區腦組織質量的百分比作為相對梗死體積。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠海馬區NGB免疫組化染色結果及陽性細胞數對比

免疫組化染色后，A組大鼠海馬區神經元胞體及突起內有棕黃色的NGB陽性顆粒，排列整齊。B組大鼠海馬各區及齒狀回NGB陽性細胞分布稀疏，數目較A組、C組明顯減少，差別有統計學意義(P＜0.05)。見圖1和表1。

表1 高倍鏡下各組大鼠海馬各亞區及齒狀回NGB陽性細胞數對比 個±s

表1 高倍鏡下各組大鼠海馬各亞區及齒狀回NGB陽性細胞數對比 個±s

注:與A組對比，*P＜0.05;與 B組對比，#P＜0.05。

組 別 動物數CA1 CA2 CA3 DG A 組 15 18.20 ±0.15 17.62.±1.06 17.93 ±1.15 14.16 ±2.61 B 組 15 11.31 ±0.411 10.85 ±1.13* 10.67 ±1.05* 9.01 ±0.29*C 組 15 15.63 ±0.162 14.41 ±1.52# 15.01 ±0.26# 12.81 ±0.35#

2.2 各組大鼠腦組織梗死體積對比

C組較B組能在一定程度上減少大鼠腦缺血再灌注損傷后的腦組織梗死范圍，差別有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腦組織梗死體積對比 ±s

表2 各組大鼠腦組織梗死體積對比 ±s

注:與B 組對比，#P ＜0.05。

組別 動物數/只 腦組織梗死體積/%A組15 0.00 ±0.00 B 組 15 29.87 ± 1.32 C 組 15 20.50 ± 0.08#

3 討論

腦缺血再灌注損傷屬于中醫學“中風”范疇，病機為臟腑陰陽失調，氣血逆亂，腦脈閉阻。因此治療中風的基本原則為補益氣血、行氣活血、疏通腦脈、滋養腦髓［5］，改善腦部缺血缺氧癥狀。當歸補血湯是中醫補氣生血代表方劑，方中重用黃芪大補脾氣，以資氣血生化之源，使氣旺血生;同時配以少量甘辛而溫的當歸養血和營，則陽生陰長，脾運得健，氣旺血生［6］;加味藥黨參亦具有較強的補氣益血功效。三藥配伍，扶正固本，標本兼治。NGB與腦組織對氧的利用密切相關，增加腦內NGB的表達對神經元有明顯的保護作用［7］。目前認為:大腦海馬區(尤其是CA1區)是對缺血缺氧性損傷耐受性最差的區域［8］。研究發現:NGB主要參與氧在中樞神經系統中的轉運與貯存，在神經系統的氧攝取、運輸和利用等過程中起著極其重要的作用，是一種內源性神經保護因子，在腦保護、改善神經功能和預后等方面起著重要的作用［9］。缺血性腦損傷后遺癥的發生和神經再生障礙相關。一直以來，人們普遍認為受損的神經細胞不能再生的主要原因是缺乏神經保護因子等調節因素。Khan等［10］研究發現:腦組織中NGB的表達增加可以降低轉基因小鼠的腦梗死體積，提示NGB在腦缺血缺氧性損傷中對神經元有保護作用。

本研究結果表明:大鼠腦缺血再灌注損傷后NGB免疫反應陽性神經元的表達數目顯著降低，而加味當歸補血湯能夠增加大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬區NGB陽性神經元的表達，同時一定程度上減少了腦缺血再灌注損傷后大鼠的腦組織梗死體積。此證明加味當歸補血湯的配方選材及其對腦缺血再灌注損傷的療效是可以肯定的，但因腦缺血再灌注損傷后的神經修復機制十分復雜，加味當歸補血湯為中藥復方，故其對腦缺血再灌注損傷的神經保護作用及其相關機制還有待做進一步研究。

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