大黃素對大鼠腎間質纖維化干預作用的實驗研究

魏建波 劉 琴 鐘 瑜 姜 凱 浙江省立同德醫院 杭州 310012

腎間質纖維化是腎臟疾病慢性進展直至發生終末期腎病的重要因素[1]，臨床有應用大黃或以大黃為主藥治療腎間質纖維化疾病[2-3]，并且取得較好療效。筆者觀察大黃提取物大黃素對大鼠腎間質纖維化防治的干預作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動 物 Wistar雄性大鼠60只，體質量（180±20）g，清潔級，浙江省中醫藥研究院動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK（浙2008-0033）。

1.2 藥物和主要試劑 大黃素，成都茂辰生物科技有限公司生產；I型膠原（C-I）、Ⅲ前膠原肽（PⅢP）、透明質酸（HA）ELISA檢測試劑盒購自上海瑞奇生物科技有限公司；Trizol試劑盒，購自Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 主要儀器 低溫高速離心機為美國Beckman Coulter；PCR擴增儀為美國ABI公司產品；凝膠電泳儀為美國伯樂公司產品。

2 方法

2.1 大鼠造模與給藥 常規飼養大鼠1周后，將60只大鼠隨機分為假手術對照組、模型組及大黃素小、中、大劑量組各12只。將大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于手術臺上，進行氣管插管。除假手術組外，其余各組大鼠結扎左側輸尿管近腎盂段制備腎間質纖維化模型，假手術對照組行手術但不結扎。次日大黃素各組分別給予大黃素25、50和80mg/kg腹腔注射給藥，1周3次，共4周。假手術對照組、模型對照組用等量生理鹽水代替。

各組動物于造模后28天后，眼球取血后處死。大鼠血離心后，取血清-20℃保存備用；左側腎臟行原位灌流去除血細胞后，腎組織液氮中凍存備用。

2.2 觀察指標 ①各組大鼠生存狀況并記錄生存曲線。②血清 C-I、PⅢP、HA含量檢測：采用ELISA方法檢測血清中C-I、PⅢP、HA含量。③RT-PCR檢測大鼠腎組織TGF-βmRNA的表達：采用Trizol一步法示提取組織總RNA。按逆轉錄試劑盒方法進行RT-PCR，mRNA定量采用半定量的RT-PCR法。引物序列如下：TGF-β 上游：5’-gaagtggatccacgagcccaag-3’，下游：5’-gctgcacttgcaggagcgcac-3’，內參照GAPDH 上游：5’-tggaatcctgtggcatccatgaaac-3’,下游：5'-acgcagctcagtaacagtccg-3’。PCR反應擴增條件為：94℃，30sec；54℃，40sec；72℃，1min；30個循環。PCR產物于2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統對PCR產物進行定量分析，以對GAPDH相對值記錄結果。

2.3 統計學方法 應用SPSS12.0統計軟件，數據以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 生存曲線 記錄各組大鼠實驗開始至第28天的生存狀況。對照組大鼠第28天時存活10只，模型組大鼠第28天僅存活4只，大黃素小劑量組、中劑量組、大劑量組大鼠到第28天時分別存活6只、7只和8只，較模型組有明顯升高。見圖1。

圖1 各組大鼠生存曲線

3.2 大黃素對腎間質纖維化大鼠血清C-I、PⅢP、HA含量影響 與對照組比較，模型組大鼠血清C-I、PⅢP、HA含量顯著升高（P均＜0.01）；與模型組比較，大黃素各組血清C-I、PⅢP、HA含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），見表1。

3.3 大黃素對腎間質纖維化大鼠腎組織TGF-βmRNA表達的影響 腎組織TGF-βmRNA RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2。將電泳條帶進行凝膠成像比較分析，見圖3，模型組腎組織TGF-βmRNA表達高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。大黃素各劑量組TGF-βmRNA表達與模型組比較顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 各組大鼠血清中C-I、PⅢP、HA含量比較（±s） μg/L

表1 各組大鼠血清中C-I、PⅢP、HA含量比較（±s） μg/L

注：與對照組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

n/只C-I PⅢP HA 組 別

圖2 腎組織TGF-βmRNA RT-PCR凝膠電泳圖

圖3 大黃素對腎間質纖維化大鼠腎組織TGF-βmRNA表達的影響

4 討論

大黃素是從大黃生藥中分離提純的有效成分之一，具有抑菌消炎、抗氧化，以及抗腫瘤、調節胃腸活動、抗肝腎纖維化等多種藥理作用[4-6]。本實驗采用單側輸尿管梗阻法制備腎間質纖維化模型[7]。腎間質纖維化是腎間質細胞增生，腎間質膠原過度沉積，最終導致纖維化的過程。

I型膠原（C-I）、Ⅲ前膠原肽（PⅢP）、透明質酸（HA）是觀察纖維化過程的重要指標。實驗結果顯示，與模型組相比，大黃素能明顯降低大鼠血清HA、C-I和PⅢP水平，說明大黃素有較好的抑制細胞外基質合成，促進其降解，減輕腎纖維化作用。大黃素給藥組大鼠最終生存數量明顯多于模型組，提示大黃素可能具有治療腎纖維化的作用。

轉化生長因子（TGF-β）是公認的促纖維化發生、發展的關鍵因子之一，在腎間質纖維化的進程中起重要作用［8］。本實驗發現模型組大鼠腎組織TGF-βmRNA表達水平明顯高于對照組，經大黃素干預治療后，TGF-β表達顯著降低，提示降低TGF-β的表達量可能是大黃素抗腎間質纖維化的作用機制之一。

［1］EddyAA.Molecularbasisofrenal fibrosis［J］.PediatrNephrol，2000，15:290-301.

［2］劉明，何學紅，李林，等.大黃在慢性腎功衰竭不同階段的應用［J］.中醫藥學刊，2006，24（1）：45-46.

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［4］嚴澤軍，程躍，蔣軍輝，等.大黃素通過非Caspase依賴通路誘導膀胱癌細胞BIU87凋亡的機制［J］.中華泌尿外科雜志，2012，33（4）：259-263.

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［6］BhadaufiaM ，Shrivastava S，Nirala SK，etaL.Emodin reverses CCL4 induced hepatic cytochrome P450（CYP）enzymatic and ultrastructural changes：The in vivo evidence［J］HepatolRes，2009，39（11）：290-300．

［7］張志新，何立群.腎小管間質纖維化動物模型的研究進展［J］.時珍國醫國藥，2010，21（4）：969-971．

［8］DoiS，Zou Y，Togao O，etaL.Klotho inhibits transferming growth factor-beta1（TGF-betal）signalingand suppresses renal fibrosisand cancermatastasis inmice［J］.JBiolChem，2011,286:8655-8665.