中國北方漢族人CYP7A1 基因rs2162459 多態性與阿托伐他汀療效的關系*

王國昌， 陳曉明， 李淑元， 張娜娜， 鄭麗娟，陳甜甜， 莊茂強， 張 琳， 陳煥芹， 呂 明△

(山東大學齊魯醫院1 臨床流行病研究室，2 老年心血管內科，山東 濟南250012;3復旦大學現代人類學教育部重點實驗室，上海200433)

目前研究認為人體對藥物降脂療效是由遺傳和環境因素共同作用所致，而遺傳決定了機體對藥物處置差異的20% ～95%［1-2］，提示人們可以在研究基因序列的多態性變異方面探索決定藥物療效差異的因素。國內有研究發現細胞色素P-450 第7 家族A亞族多肽1(CYP7A1)基因第1 內含子rs8192870［3］以及A-204C 位點的多態性均與阿托伐他汀降低LDL 的療效有關［4，13］。膽固醇7α-羥化酶由CYP7A1編碼，是體內膽固醇轉化為膽汁酸的經典合成途徑的第一限速酶［5-6］，而膽固醇轉化為膽汁酸是其體內代謝的主要去路［7-9］。rs2162459 位于CYP7A1 基因的第1 內含子區域，本研究旨在探討rs2162459 位點多態性和阿托伐他汀降脂療效的關系。

材 料 和 方 法

1 研究對象

研究對象來自于2011 年3 月至2011 年12 月山東大學齊魯醫院心內科收治的高脂血癥入院患者，均為漢族人，共200 例。納入標準:受試者總膽固醇(total cholesterol，TC)≥5.72 mmol/L(220 mg/dL)或甘油三酯(triglyceride，TG)≥1.70 mmol/L(150 mg/dL)或使用調脂藥，受試者接受藥物洗脫期2 周，年齡18 ～70 周歲，無活動性肝病，依從性較好，整個研究期間保持低脂低膽固醇飲食;排除標準:對羥甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶抑制劑高度過敏者，心功能三級或四級，血壓控制不佳者即收縮壓＞180 mm-Hg 或舒張壓＞110 mmHg，繼發性高脂血癥患者，高膽紅素血癥，腎功能損害或伴有腎病綜合癥以及曾經或現患肌肉組織疾病，仍在服用已知會影響血脂水平或與研究藥物存在相互作用或與研究藥物合用會增加橫紋肌溶解危險性的藥物。患者研究期間口服阿托伐他汀20 mg/d，服用8 周。

2 高脂血癥降脂療效的判斷標準

根據衛生部1993 年頒發的《心血管藥物臨床研究指導原則》和中華人民共和國衛生部1998 年頒布的《藥物臨床研究指導原則規定》標準進行療效判定，分別統計治療8 周后的血清低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、TC、TG及高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)的變化百分率，標準如下:

有效:與用藥前相比，復查時達到以下任意一項:TC 下降10% ～20%，TG 下降20% ～40%，HDL-C 上升0.104 ～0.260 mmol/L，LDL-C 下降10% ～20%。

無效:未達到有效標準者。

3 方法

3.1 臨床資料和血液樣本的收集 在患者知情同意的基礎上采用專門的調查表對研究對象進行面對面訪談，內容包括一般項目、生活方式、病史及家族史、調脂藥物用藥史。分別于研究的0 和8 周采集早晨空腹靜脈血5 mL，抗凝血用于DNA 提取，非抗凝血用于生化指標的檢測。

3.2 生化指標測定 采用日立717S 全自動生化分析儀測定患者的TC、TG、LDL-C、HDL-C、載脂蛋白A、載脂蛋白B、脂蛋白(a)以及腎功能和血糖等指標，此過程由山東大學齊魯醫院檢驗科協助完成。

3.3 DNA 的提取 取收集好的抗凝血2 mL，采用北京艾德萊生物科技有限公司提供的小量全血基因組提取試劑盒抽提基因組DNA，NanoDrop 3.8.1 分光光度計檢測其濃度，標化至10 mg/L，-20 ℃冷凍以備基因型檢測。

3. 4 多重單堿基延伸SNP 分型技術( multiplex SNaPshot) 檢測CYP7A1 基因多態性

3.4.1 原理 在一個含有測序酶、4 種熒光標記的ddNTP、緊挨多態位點5'端的不同長度延伸引物和PCR 產物模板的反應體系中，引物延伸1 個堿基即終止，如果是雜合子，2 種堿基都得到延伸，從而表現為雙峰，而純合子只有1 種堿基得到延伸，表現為相應的單峰，經ABI 測序儀跑膠后，根據峰的顏色可知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型，根據峰移動的膠位置確定該延伸引物對應的SNP 位點。該技術分型準確，速度快，適用于小樣本多位點的基因型檢測。

3.4.2 工作流程

①引物合成 委托上海英濰捷基貿易有限公司完成引物合成，正向引物5'-GGCCCATCCAACAAAAGAAAT-3'，反向引物5'-GCAGAGCACAGCCCAGGTAT-3'，延伸引物5'-TTTTTTTTTTTTTTCGTTTGCCTGTCAGACACAA-3'。②待分析片段的PCR 擴增 PCR 反應體系(8 μL):包括10 ×buffer 0.8 μL，0.5 μL MgCl2(25 mmol/L)，1 μL dNTP 混合物(10 mmol/L)，待定型分析片段的PCR 擴增用引物(正向引物和反向引物)0. 1 μL，FastStar Taq 酶0.15 μL，DNA 模板1 μL(10 mg/L)，ddH2O 4.45 μL。采用Touchdown PCR 反應程序:95℃預變性15 min，94 ℃20 s，62 ℃40 s，-0.5 ℃/循環，72 ℃90 s，共11 個循環。然后94 ℃20 s，57 ℃30 s，72 ℃90 s，共22 個循環。最后72 ℃5 min。反應產物純化:取2 μL 的待定型分析片段模板中加入1 μL 蝦堿性磷酸酶(Promega)和0. 2 μL 外切酶(ExonⅠ)，反應體系混勻，37 ℃反應80 min，75 ℃15 min 失活蝦堿性磷酸酶，完成PCR 產物純化。

③SNaPshot 反應 反應體系(6 μL)包括:5 ×buffer 1.2 μL，SNaPshot Master Mix 1 μL(ABI)，延伸引物混合物2 μL，純化的待定型分析片段模板1 μL，ddH2O 0.8 μL。反應程序:96 ℃預變性1 min，96 ℃10 s，52 ℃5 s，60 ℃30 s，共28 個循環。單堿基延伸反應產物的純化:在上述的反應體系中加入1 μL蝦堿酶，反應體系混勻，37 ℃80 min，75 ℃15 min完成SNaPshot 產物純化。

④DNA 測序儀測序 在上述純化產物(1 μL)中加入9 μL 的分子量內標GeneScan-120 LIZ(Applied Biosystems;0.2 μL)和甲酰胺(Hi-DiTMformamide;Applied Biosystems;8.8 μL)的混合物，混勻，由ABI 3130基因分析儀毛細管電泳分析，運行Peak Scanner 1.0軟件分析，讀取測序結果。

上述基因型測定過程在復旦大學現代人類學教育部重點實驗室完成。

4 統計學處理

計量資料用均數±標準差(mean ±SD)表示，組間均數的比較采用t 檢驗或方差分析，計數資料的比較用χ2檢驗，運用Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗樣本的代表性。采用多元logistic 回歸模型分析rs2162459 位點基因多態性和阿托伐他汀降脂療效之間的關系。采用SAS 9.1 軟件完成。

結 果

1 高脂血癥患者的一般臨床資料

高脂血癥患者共有200 例，男女分別為127 和73 例，既往各種疾病史等資料見表1。

表1 高脂血癥患者的臨床資料Table 1. Clinical data of hyperlipidemia patients(n=200)

2 rs2162459 位點Hardy-Weinberg 遺傳平衡的檢驗

rs2162459 位點3 種基因型頻數分別為43、106和51，等位基因A 和G 的頻率分別是48%和52%。χ2檢驗的結果顯示rs2162459 位點基因型頻率符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡，χ2=0.7613，P ＞0.05，說明收集的樣本具有群體代表性。

3 rs2162459 位點基因型頻率和等位基因頻率分布的特點

表2 顯示rs2162459 位點基因型和等位基因頻率的分布情況，根據降脂療效的不同，把4 種血脂指標分成有效組和無效組，比較兩組之間的基因型和等位基因的分布。rs2162459 基因型AA、GA、GG 以及等位基因A 和G 在兩組中的分布差異有統計學意義(P ＜0.05)。

4 rs2162459 位點基因多態性和臨床生化指標的關系

表3 顯示rs2162459 位點基因多態性和基線血脂水平的關系，HDL-C 水平在rs2162459 三個基因型AA、GA 和GG 間的差別具有統計學意義，P ＜0.05，從AA、GA 到GG 高密度脂蛋白膽固醇水平依次降低，濃度分別為(1. 36 ± 0. 94)mmol/L、(1. 16 ±0.38)mmol/L 和(1.07 ±0.28)mmol/L，提示基因型GG 和低HDL-C 水平有一定的關系。

表2 rs2162459 位點基因型和等位基因頻率分布Table 2. The distribution of genetype and allele frequency of rs2162459

表3 rs2162459 位點基因多態性與基線血脂水平的關系Table 3. Association of rs2162459 polymorphism with the baseline lipid levels(Mean±SD)

5 Logistic 回歸分析rs2162459 位點基因多態性與阿托伐他汀降脂療效的關系

為研究CYP7A1 基因多態性與血脂療效的關系，我們按照不同的遺傳模式分別構建了rs2162459 位點的廣義模型、加性模型、顯性模型和隱性模型，并根據統計學方法構建了基本模型、年齡調整模型和多因素調整模型。

表4 表示rs2162459 位點不同遺傳模式下HDLC 調脂療效的logistic 回歸分析，經過多元校正后3種模型的結果分別為:OR =1. 74，95% CI:1. 09 ～2.77;OR =2. 86，95%CI:1. 13 ～7. 25;OR =2. 21，95%CI:1.12 ～4.33。以上結果均提示等位基因G和基因型GG 與阿托伐他汀的升HDL-C 作用有關。

表4 rs2162459 位點不同遺傳模式下阿托伐他汀升高HDL-C 作用的logistic 回歸分析Table 4. Logistic regression analysis of HDL-C-elevating effect of atorvastation at rs2162459 locus in different genetic models

討 論

他汀類藥物通過特異性抑制膽固醇合成酶降低血液中的LDL-C、TG、TC 以及升高HDL-C，從而調節血脂，但是他汀類降脂療效會在很大范圍內波動。目前已經認識到藥物療效除了與年齡、性別和飲食等環境因素有關外，還受藥物基因控制的藥物代謝、藥物轉運、藥物受體及藥物作用靶點［2］的基因多態性的影響。

CYP7A1 基因位于8 號染色體長臂(8q11 ～q12)，長度10 kb，有6 個外顯子和5 個內含子組成。膽固醇7α-羥化酶是肝內膽汁酸合成的限速酶，CYP7A1 基因的變異可致膽固醇和膽汁酸代謝的障礙。CYP7A1 第6 外顯子純合子1302 ～1303TT 的缺失突變引起了L413FsX 框架位移，并造成膽固醇7α-羥化酶的缺陷，進而導致高膽固醇血癥［10］;另有小鼠實驗表明CYP7A1 的過度表達可以避免高脂飲食引起的高膽固醇血癥、肥胖及胰島素抵抗［11］。現在的研究主要集中在CYP7A1 基因啟動子區域A-278C 的單核苷酸多態性。Wang 等［12］最先發現CYP7A1 的啟動子區域A-278C 位點純合子基因型CC 與LDL-C 的高濃度有關;隨后Kajinami 等［13］在324 例高脂血癥患者中研究發現CYP7A1 的A-204C位點處，當個體的基因型發生CC→AC→AA 變化時LDL-C 下降的水平逐漸增大(P ＜0.05)，但后續的研究結果并不完全一致。

我們的研究位點rs2162459 位于CYP7A1 基因的第1 內含子區域，采用multiplex SNaPshot 對rs2162459 位點進行基因分型，等位基因A 和G 的頻率分別是48%和52%，接近HapMap 中報告的中國人的頻率43.3%和56.7%。在4 種血脂指標的有效組和無效組基因型頻率和等位基因頻率的比較中，發現HDL-C 的基因型和等位基因頻率分布差異有統計學意義(均P ＜0.05)。在rs2162459 位點基因多態性和臨床生化指標的關系中，我們發現AA、GA和GG 基因型個體的基線HDL-C 水平依次降低(P ＜0.05)，提示基因型GG 和低基線HDL-C 水平有一定關系。

本研究在rs2162459 位點多態性和阿托伐他汀降脂療效的logistic 回歸分析中發現基因型GG 攜帶者與AA 攜帶者相比，升高HDL-C 的效果更明顯。經過年齡、性別、吸煙和飲酒的多因素校正后，加性模型中ORG/A=1.74，95%CI:1.09 ～2.77;在廣義遺傳模型比較中ORGG/AA=2.86，95%CI:1.13 ～7.25;在顯性模型比較中，ORGG/AA+GA=2.21，95%CI:1.12～4.33，提示基因型GG 與阿托伐他汀升高HDL-C的療效相關。

綜上所述，rs2162459 位點的基因多態性與阿托伐他汀的降脂療效可能有一定的關系。另外該位點位于基因的非編碼區，只能引起表達調控和表達水平的改變，但由于血脂水平的異常受多基因和多個環境因素水平的影響，單一基因的作用或許微不足道。我們期待大樣本、多基因的研究深入探討基因多態性與他汀類降脂療效的關系，為臨床個體化用藥方案提供分子理論依據。

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