超聲微泡靶向遞送aFGF 對糖尿病心肌病的治療作用及其機制研究*

田新橋， 茹 翱， 趙應征， 李劍敏， 鄭 磊， 金可可， 張 超

(1溫州醫科大學附屬第二醫院超聲科，浙江 溫州325027;2 溫州醫科大學，浙江 溫州325035;3溫州醫科大學附屬第一醫院病理科，浙江 溫州325027)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是由糖尿病(diabetes milletus，DM)引起的一系列心肌代謝和結構異常的病理改變，為糖尿病的常見慢性并發癥之一。流行病學資料顯示，DCM 患者日益增多，已成為DM 患者易發心衰和死亡的主要原因［1］，嚴重影響患者的預后。然而，目前臨床上尚缺乏對DCM 的有效治療方法。研究證實，心肌微血管病變、心肌間質纖維化及細胞凋亡為DCM 的特征性改變，因此，促微血管新生，減輕心肌間質纖維化及抗心肌細胞凋亡可能成為治療DCM 的策略之一。酸性成纖維細胞生長因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)最初由Thomas 于1984 年從牛腦中分離純化得到，具有誘導血管新生、促進膠原水解、抗氧化損傷及神經營養保護等多種生物學作用［2-3］。因此，aFGF 對DCM 防治應具有較大潛力。然而，由于aFGF 在體外極易被氧化失活，且缺乏高效安全的心肌靶向遞送載體，故aFGF 目前在臨床上僅局限于外用治療燒傷、創傷、皮膚潰瘍及皮膚護理等方面，其在體研究仍處于初步研究階段，且多集中于缺血性心臟病動物實驗，如學者Geist 等［3］在新西蘭兔缺血心肌梗死區注射aFGF，1 周后觀察證實aFGF 可以增加缺血梗死區心肌血流量及微血管密度。迄今鮮見aFGF 用于治療DCM 的報道。

近年來，以超聲微泡作為藥物/基因遞送載體進行疾病靶向治療的報道日益增多，超聲微泡目前已成為又一種新的藥物轉載系統。本研究選用SonoVue 超聲微泡作為aFGF 的遞送載體并結合超聲靶向微泡擊破技術(ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD)對DCM 大鼠進行干預，旨在觀察該方法對DCM 大鼠左心室舒縮功能的保護作用并初步探討其可能機制，為DCM 的防治研究提供新的思路和實驗依據。

材 料 和 方 法

1 動物

健康雄性SPF 級Sprague-Dawley 大鼠40 只，鼠齡40 ～50 d，體質量170 ～230 g，由溫州醫學院實驗動物中心代購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物使用許可證號為SYXK(浙)2010-0150。

2 主要試劑

aFGF 干粉由溫州醫科大學藥學院提供(廣州暨南大學醫藥生物技術研究開發中心研制，200 μg≈1 800 U);SonoVue 超聲微泡造影劑由Bracco 生產，微囊為磷脂成分，內包裹六氟化硫氣體，90%微泡直徑＜6 μm，平均直徑約2. 5 μm;鏈脲佐菌素購自BBI，上海生工生物有限公司分裝，注射前用0. 1 mol/L、pH 值4.0 ～4.4 的檸檬酸緩沖液配制;兔抗鼠CD31 Ⅰ抗購自上海生工生物有限公司;改良Masson 三色染色液購自武漢谷歌生物科技有限公司;TUNEL 染色試劑盒為In situ Apoptosis Detection Kit (DMK500)，購自TaKaRa。實驗儀器為Siemens公司Acuson Sequoia 512C 彩色多普勒超聲診斷系統，15L8w-S 線陣探頭，探頭頻率為12 ～14 MHz;動物呼吸機型號為HX-300，購自成都泰盟科技有限公司。

3 主要方法

3.1 動物造模及分組 所有大鼠適應性喂養7 d后，隨機挑選28 只腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液70 mg/kg 體質量，注射后第1 天、第3 天及第7 天取尾靜脈血測定血糖濃度，血糖值＞16.7 mmol/L 且尿量和飲水量明顯增多者繼續飼養至第8 周，進行超聲心動圖檢測，出現心功能異常者納入DCM 模型組(24 只大鼠成模;4 只未成模而剔除)。其余12 只作為正常對照組，腹腔內注射等量檸檬酸緩沖液。

3.2 攜載aFGF 微泡造影劑( SonoVue-aFGF) 制備

臨用前將7 mg aFGF 凍干粉與5 mL 生理鹽水混合，輕度振搖充分溶解后形成aFGF 溶液，再加入到SonoVue 瓶中，于室溫下靜置10 ～20 min 進行孵育，期間輕柔振蕩數次，形成SonoVue-aFGF 溶液。

3.3 實驗處理 24 只DCM 大鼠隨機平均分成DCM 組和aFGF 治療組。aFGF 治療組大鼠充分麻醉后，將探頭置于大鼠心前區，取乳頭肌水平左室短軸觀，聚焦深度3.5 ～4.0 cm，經尾靜脈注射攜aFGF微泡造影劑0.1 mL，當心肌內見大量微泡充盈時即用機器自帶MBD 功能反復多次擊破微泡(機械指數MI=1.9)，直至微泡完全消失，見圖1。正常對照組與DCM 組不做任何處理。于第2 天重復上述給藥處理1 次。隨后所有大鼠再飼養4 周(飼養過程中DCM 組死亡2 只)。干預后4 周，所有實驗大鼠充分麻醉，切開大鼠頸前區皮膚，分離氣管，接動物呼吸機，打開大鼠胸腔，將心導管從心尖直接刺入大鼠左心室內，Chart 5 for Windows 軟件同步記錄左室收縮末壓力(left ventricular end-systolic pressure，LVESP)、左室舒張末壓力(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)和左室內壓最大上升及下降速率(maximal increase/decrease rate of left ventricular pressure，LV ± dp/dtmax)。實驗結束時處死大鼠，取心臟，行CD31 免疫組織化學染色、改良型Masson 膠原染色和TUNEL 染色。

Figure 1. The process of ultrasound-targeted microbubble destruction (UTMD).A:the left ventricular myocardium was filled with contrast agents;B:targeted break;C:the microbubbles were cracked by UTMD.圖1 超聲靶向微泡擊破過程

3.4 CD31 免疫組織化學染色 采用Polymer 法對心肌組織石蠟切片進行CD31 免疫組化染色，嚴格按照試劑盒說明書進行。封片后在顯微鏡下觀察，微血管被染成棕褐色。每組取12 張切片，每張切片隨機取20 個400 倍視野計算微血管數量，取其均值，作為心肌組織微血管密度(microvessel density，MVD;個/高倍視野)。

3.5 改良型Masson 膠原染色及心肌膠原容積分數( collagen volume fraction，CVF) 測量 心肌組織石蠟切片脫水后嚴格按照試劑盒說明書進行。封片后在顯微鏡下觀察，膠原纖維呈藍色，心肌纖維及紅細胞呈紅色。隨后應用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析測量心肌CVF:每組取12 張切片，每張切片隨機取20 個200 倍視野，CVF(%)=膠原面積/總面積×100%，取其均值。

3.6 TUNEL 法檢測心肌組織細胞凋亡指數( apoptotic index，AI) 心肌組織石蠟切片脫水后嚴格按照試劑盒說明書進行。結果判斷:陽性細胞核呈棕色，陰性細胞核呈藍色，紅細胞呈透明無核黃色。每組取12 張切片，每張切片隨機取20 個400 倍視野，計數該視野細胞中染色陽性的細胞數，AI(%)=視野內的陽性細胞數/視野內總的細胞數×100%。

4 統計學處理

采用SPSS 19.0 統計軟件，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組均數間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，若有差別，用LSD 檢驗進行兩兩比較。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠左心室血流動力學指標的改變

干預后4 周，DCM 組大鼠LVESP 和LV ± dp/dtmax與正常對照組相比分別減低29%、31%和32%(P ＜0.01)，LVEDP 則較正常對照組增高37%(P ＜0.01)，說明DCM 組大鼠左心室舒縮功能已經出現明顯損害;而aFGF 治療組大鼠LVESP 和LV ±dp/dtmax與DCM 組相比分別增高20%、35% 和29%(P ＜0.01)，LVEDP 較DCM 組 減 低18% (P ＜0.01)，表明超聲微泡靶向遞送aFGF 后，大鼠左心室舒縮功能有所好轉，aFGF 干預可以有效改善DCM大鼠的左心室舒縮功能，見表1。

表1 左心室血流動力學指標的改變Table 1. Changes of left ventricular hemodynamic parameters(Mean±SD)

2 各組大鼠心肌MVD 改變

干預4 周后，CD31 免疫組織化學染色顯示，正常對照組大鼠心肌內有較多微血管且排列整齊;DCM 組大鼠心肌內微血管明顯減少、稀疏;aFGF 治療組大鼠心肌內微血管數量較DCM 組大鼠明顯增多。DCM 組大鼠MVD 比正常對照組低58%(P ＜0.01)，aFGF 治療組大鼠則較DCM 對照組增加64%(P ＜0.01)，表明超聲微泡靶向遞送aFGF 后明顯增加DCM 大鼠心肌微血管，見圖2、表2。

Figure 2. The expresults of CD31 in rat myocardium in the three groups examined by immunohistochemical staining (×400).A:control group;B:DCM group;C:aFGF treatment group.圖2 免疫組化染色檢測3 組大鼠心肌組織CD31 表達

表2 心肌微血管密度、膠原容積分數及凋亡指數Table 2. Results of microvessel density (MVD)，collagen volume fraction (CVF)and apoptotic index (AI)in rat myocardium(Mean±SD)

3 各組大鼠心肌CVF 改變

干預后4 周，改良型Masson 膠原染色觀察顯示，正常組大鼠心肌內膠原含量較少，主要以心肌纖維、纖維素等為主;DCM 組大鼠心肌內膠原大量增生，幾乎充滿整個視野區;而aFGF 治療組大鼠心肌內膠原含量明顯減少。DCM 組大鼠CVF 比正常對照組增高67%(P ＜0.01)，aFGF 治療組大鼠則較DCM 對照組減低24%(P ＜0.01)，表明超聲微泡靶向遞送aFGF后明顯降低DCM 大鼠心肌膠原含量，見圖3、表2。

Figure 3. The expression of collagen in rat myocardium in the three groups detected by improved Masson staining (×200).A:control group;B:DCM group:C:aFGF treatment group.圖3 3 組大鼠心肌膠原染色結果

4 各組大鼠心肌組織AI 改變

干預后4 周，TUNEL 法染色結果顯示，正常組大鼠心肌內僅有少數細胞發生凋亡，而DCM 大鼠心肌內出現大量心肌細胞凋亡現象，aFGF 治療組大鼠心肌細胞凋亡則明顯減少。DCM 組大鼠AI 比正常對照組增高291%(P ＜0.01)，aFGF 治療組大鼠則較DCM 對照組減低49%(P ＜0.01)，表明超聲微泡靶向遞送aFGF 后具有明顯抗DCM 心肌細胞凋亡的作用，見圖4、表2。

Figure 4. Apoptosis of myocardial cells of rats in the three groups staining detected by TUNEL (×400). A:control group;B:DCM group;C:aFGF treatment group.圖4 TUNEL 法3 組大鼠檢測心肌細胞凋亡

討 論

aFGF 是成纖維細胞生長因子家族成員之一，在促進細胞生長、組織形成、誘導血管新生等方面具有重要的作用。aFGF 對缺血心肌的促微血管再生作用由Banai 等于1991 年首先開始研究，已經證實aFGF 具有促進心肌微血管新生、降解心肌膠原、擴張血管、缺血保護、神經營養等生物學效應［4］。此外，李彥等［5-6］與Palmen 等［7］的研究均發現，aFGF 還具有顯著降低缺血心肌細胞凋亡率，提高心肌抗氧化的能力。DCM 是指糖尿病導致的特異性心肌病變，其確切發病機制至今尚未完全明了。已有的研究表明，DCM 的始動因素為心肌能量代謝異常、氧化應激、心肌微血管病變、心肌間質纖維化等多因素共同促進DCM 的病理發展。其中微血管病變與心肌間質纖維化為DCM 的特征性改變，氧化應激在DCM的病程演進中扮演著重要的角色。氧化應激一方面可損傷DNA 和線粒體膜，釋放線粒體中的凋亡活性物質，啟動細胞凋亡程序，增加心肌組織細胞凋亡率［8-9］;另一方面促進晚期糖基化終產物(advanced glycosylation end products，AGEs)的增多。AGEs 增多可破壞心肌膠原生成與降解之間的平衡，導致心肌間質纖維化，加重心肌僵硬度，影響心肌舒縮功能［10］，同時，AGEs 增多聚集可使心肌微血管基底膜增厚、管腔橫截面積減小、微血管密度減低，導致心肌微循環障礙、心肌細胞缺血損傷和壞死。因此，aFGF 對于DCM 的治療應該具有重要的價值。然而，由于缺乏合適的遞送載體，目前aFGF 的體內應用仍局限于采用直接心肌、靜脈或腹腔注射方式的動物實驗研究，迄今尚無aFGF 用于治療糖尿病心肌病的報道。實現aFGF 的靶向遞送使其發揮相應的生物學效應，關鍵在于構建一種高效、安全的遞送載體。

近年來大量研究表明，超聲微泡可以攜帶各種藥物/基因，利用微泡被超聲能量靶向擊破時產生的空化效應和聲孔效應，遞送藥物/基因進入靶細胞或靶組織，達到治療目的［11-12］，與質粒和腺病毒載體相比，既提高了遞送效率，又不會產生以腺病毒為載體時引起的免疫反應。國內王瀟等［13］已應用SonoVue劑介導Ang-1 基因靶向治療心肌梗死，證實該方法可有效改善心肌梗死動物左室心肌功能。因此以超聲微泡作為aFGF 的心肌靶向遞送載體，克服了aFGF直接心肌注射存在有創性和操作復雜性等問題，同時實現aFGF 的靶向、高效、安全遞送。目前Zhao等［14］已經應用攜載aFGF 的微泡治療心肌梗死，證實攜載aFGF 的微泡可有效改善心肌梗死動物的心功能。

本研究構建攜載aFGF 的SonoVue 微泡，以超聲靶向微泡擊破技術作為遞送手段，利用超聲能量使微泡在心肌組織靶向破裂，從而將aFGF 定向釋放并發揮作用，干預后4 周應用心導管檢測心功能變化，觀察發現aFGF 治療組大鼠左心室各項收縮功能指標均較DCM 組明顯改善。CD31 免疫組織化學染色、改良型Masson 膠原染色及TUNEL 法檢測AI 的結果亦證實，aFGF 治療組心肌微血管數量較DCM組明顯增多，膠原含量較DCM 組明顯減少，細胞凋亡較DCM 組明顯減輕。分析其原因，微泡被超聲能量靶向擊破時產生的空化效應可以在其周圍形成高能環境［11］，隨后形成作用于內皮細胞膜與毛細血管上的沖擊波，沖擊波產生的切應力可以使膜上出現暫時性開放小孔即聲孔效應［15］，從而導致細胞膜通透性增加，使較多的aFGF 通過開放小孔進入心肌組織而發揮其促血管新生、降解膠原及抗氧化的生物學功能，逐漸改善心肌微循環，減輕心肌間質纖維化，減少細胞凋亡，改善心功能。

綜上所述，超聲微泡靶向遞送aFGF 至心肌組織，可有效改善DCM 大鼠左室舒縮功能，有望成為今后DCM 治療的新策略，應用前景廣闊。本研究存在一些局限性，比如aFGF 是多種類型細胞的促有絲分裂原，其多效性有可能引起治療目的之外的細胞和組織生長，從而產生副作用;而且本研究對DCM大鼠治療的療效受超聲能量、造影劑的數量、微泡自身特性等因素的影響。因此，今后應進一步深入研究和優化該治療方法的載藥微泡濃度、應用劑量和時機以及超聲靶向爆破時機械指數等參數的設置，以能取得滿意的治療效果。

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