阿托伐他汀對(duì)碘普羅胺引起的糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響*

鄒文博， 蘇津自， 許昌聲， 蔡文欽， 馬雯雯， 陳秀平， 王芳兵

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1高血壓研究所，2心血管內(nèi)科，福建 福州350005;3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢430030)

隨著各種影像學(xué)檢查和介入診療技術(shù)的發(fā)展，含碘造影劑的使用日益頻繁，造影劑急性腎損傷(contrast-induced acute kidney injury，CI-AKI)的發(fā)病率隨之增加。CI-AKI 已經(jīng)成為醫(yī)源性急性腎功能不全的第三大原因，在急性腎功能損害病例中，大約有10%是由CI-AKI 引起的［1］。此外，CI-AKI 可增加心腦血管事件的發(fā)生率和死亡率，加重靶器官的損傷，并帶來(lái)延長(zhǎng)住院時(shí)間和增加診療費(fèi)用等諸多問題［2］。CI-AKI 的危險(xiǎn)因素已被廣泛地研究和報(bào)道，其中糖尿病被公認(rèn)為CI-AKI 的重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，在接受介入治療的正常人群中，CI-AKI 發(fā)病率不足1%，而在糖尿病人群中高達(dá)29.4%［3］。一項(xiàng)隨訪研究［4］顯示，有糖尿病基礎(chǔ)疾病的CI-AKI 患者，其2 年生存率比CI-AKI 無(wú)糖尿病的患者明顯降低。因此，如何有效地預(yù)防糖尿病人群中CI-AKI 的發(fā)生和發(fā)展，成為了介入科醫(yī)師與腎內(nèi)科醫(yī)師共同面臨的課題。目前他汀類藥物是否對(duì)CI-AKI 有保護(hù)作用目前仍存在爭(zhēng)議，為此我們?cè)谔悄虿〉幕A(chǔ)上，建立了CI-AKI 的動(dòng)物模型，初步探討阿托伐他汀對(duì)糖尿病CI-AIK 是否有保護(hù)作用及可能存在的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar 大鼠(250 ～300 g)購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(No. SCXK2007-0005)。實(shí)驗(yàn)大鼠每籠4 ～5 只，飼養(yǎng)在恒溫(22 ±2)℃、恒濕(55 ±5)%，人工光照明暗各12 h 的飼養(yǎng)室內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)飼料和自來(lái)水自由飲食。

2 主要方法

2.1 模型建立與分組 60 只清潔級(jí)Wistar 大鼠隨機(jī)分為正常組(N 組，n =8)及糖尿病造模組(n =52)，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周后，造模組以腹腔單劑量注射鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ;Sigma)40 mg/kg(溶解在10 mmol/L 枸櫞酸緩沖液中，pH 4.2 ～4.5)建立糖尿病模型，分別于72 h、5 d 和1 周后斷尾取血測(cè)血糖，以非禁食血糖≥16.7 mmol/L 為標(biāo)準(zhǔn)確定糖尿病大鼠模型是否成功，對(duì)于血糖未達(dá)標(biāo)大鼠，給予40 mg/kg 的追加劑量至達(dá)標(biāo)。普通飲食、自由攝水飼養(yǎng)8 周后，選取糖尿病模型成功者，隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組(DM 組)、糖尿病+ 造影劑組(DM + CM組)、糖尿病+造影劑+5 mg·kg-1·d-1阿托伐他汀組(ATO1 組)、糖尿病+造影劑+10 mg·kg-1·d-1阿托伐他汀組(ATO2 組)和糖尿病+造影劑+30 mg·kg-1·d-1阿托伐他汀組(ATO3 組)。將阿托伐他汀鈣片(輝瑞公司)研磨后與2 mL 飲用水混合成混懸液，分別以5、10 和30 mg·kg-1·d-1灌胃，N 組、DM 組和CM 組給予同體積飲用水連續(xù)灌胃5 d。灌胃5 d 后 以12 mL/kg 單次劑量經(jīng)尾靜脈注射碘普羅胺注射液，N 組和DM 組分別給予同體積的生理鹽水。

2.2 標(biāo)本收集 注射造影劑24 h 后，用代謝籠收集24 h 尿液，離心后取上清測(cè)尿肌酐和尿微量白蛋白;注射造影劑48 h 后，處死動(dòng)物，經(jīng)腹主動(dòng)脈收集血標(biāo)本并摘取左腎，稱重，并計(jì)算腎指數(shù)［腎重(kidneyweight，KW)/體重(body weight，BW)］;血液標(biāo)本離心后，取上清，測(cè)血清肌酐(serum creatinine，SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN);左腎部分置于10%甲醛溶液中固定，待作光鏡檢查及相關(guān)的組織學(xué)檢查。其余腎臟標(biāo)本待分離出皮質(zhì)和髓質(zhì)后，置于-80 ℃冰箱保存，待測(cè)腎臟Bax 和Bcl-2 蛋白的表達(dá)。

2.3 血糖檢測(cè) 血糖采用斷尾取血法，應(yīng)用血糖試紙和血糖儀(拜安捷公司)測(cè)定。

2.4 生化指標(biāo)測(cè)定 SCr、BUN、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、尿肌酐(urine creatinine，UCr)和24 h 尿微量白蛋(24-hour urine albumin，24 h-UAlb)等指標(biāo)由福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科日立7150 型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè);并計(jì)算肌酐清除率(creatinine clearance rate，CCr)和24 h 尿微量白蛋白排泄率(24-hour urinary albumin excretion rate，24 h-UAER)。CCr=U×V/P，U 表示尿肌酐含量(μmol/L)，V 表示尿量［mL·min-1·(100 g)-1］，P 表示血肌酐水平(μmol·L-1)，CCr單位為mL·min-1·(100 g)-1;24 h-UAER= 24 h-UAlb/(24 ×60)，24 h-UAER 單位為μg·min-1。

2.5 形態(tài)學(xué)觀察 將固定于10%甲醛中的腎組織，經(jīng)石蠟包埋后切成3μm 厚的切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇進(jìn)水，水沖洗后于蘇木素液浸泡10 ～20 min;水沖洗;1%鹽酸乙醇分化;1% 氨水還原;1%伊紅浸泡10 min;水沖洗;梯度乙醇脫水;二甲苯透明2 h;環(huán)氧樹脂封片。在光學(xué)顯微鏡下雙盲觀察，每張切片于400 倍顯微鏡下隨機(jī)選取10 個(gè)腎小管間質(zhì)視野，進(jìn)行腎小管損傷程度評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:0 分，腎小管正常，無(wú)損傷;1 分，腎小管輕度損傷(受損腎小管＜25%);2 分，腎小管中度損傷(受損腎小管25% ～75%);3 分，腎小管重度損傷(受損腎小管＞75%)。以每張切片10 個(gè)視野評(píng)分總和的均值作為腎小管損傷評(píng)分。

2.6 TUNEL 定量分析 按Dead EndTMColorimetric TUNEL System 試劑盒(羅氏公司)說(shuō)明書進(jìn)行操作。每組每只大鼠隨機(jī)選取5 個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)TUNEL 陽(yáng)性腎小管上皮細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其凋亡率。

2.7 免疫組織化學(xué)二步法檢測(cè)腎臟Bax 和Bcl-2 表達(dá) 石蠟包埋的腎組織進(jìn)行3 μm 厚的連續(xù)切片，脫蠟水化;3%過氧化氫-甲醇溶液室溫孵育30 min，Ⅰ抗(兔抗Bax 和Bcl-2 抗體，均1∶1 000;Cell Signaling Technology)4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗聚合物室溫孵育30 min，DAB 染色1 min，蘇木素復(fù)染2 min，脫水，透明，封固。

2.8 Western blotting 法測(cè)定腎臟Bax 和Bcl-2 表達(dá)

分組處理細(xì)胞后提取各組腎臟組織蛋白，取20 μL 10% SDS-PAGE 凝膠電泳(120 mV)分離蛋白，繼之80 mA轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，Ⅰ抗(兔抗Bax 和Bcl-2 抗體，均1∶1 000;Cell Signaling Technology)4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗(HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG)37 ℃孵育1 h，化學(xué)發(fā)光1 min，顯影，定影，于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行目的蛋白及內(nèi)參照條帶β-actin 灰度分析，各蛋白的表達(dá)強(qiáng)度為二者灰度的比值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 軟件包分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± SD)表示，組間比較采用One-way ANOVA 分析，LSD 法進(jìn)行多重比較。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠一般情況比較

各組間體重、腎重、ALT 和ALT 均無(wú)顯著變化(P ＞0.05);與N 組比較，各組糖尿病大鼠的血糖水平均有明顯升高(P ＜0.01)，但各組糖尿病大鼠血糖水平無(wú)明顯差異(P ＞0.05)，見表1。

表1 各組大鼠基本情況比較Table 1. Comparison of basic information in each group (Mean±SD.n=8)

2 各組SCr、CCr、BUN 和24 h-UAER 水平

與N 組比較，DM 組SCr、CCr、BUN 和24 h-UAER 水平升高(P ＜0.05);與N 組和DM 組比較，DM+CM 組SCr、BUN 和24 h-UAER 水平升高(P ＜0.05)，CCr 水平降低(P ＜0.05);與DM +CM 組比較，3 種劑量他汀治療組Scr 均有明顯下降(P ＜0.05)，且ATO3 組較ATO1 和ATO2 組均有明顯下降(P ＜0.05);ATO2 和ATO3 組CCr 水平隨劑量增加均有明顯升高(P ＜0.05)，且ATO2 與ATO3 組間有顯著差異(P ＜0.05);ATO2 及ATO3 組BUN 和24 h-UAER 水平較DM+CM 組明顯降低(P ＜0.05)，見圖1。

Figure 1. Comparisons of SCr，CCr，24 h-BUNR and UAE levels in each group. Mean ±SD. n =8. * P ＜0.05 vs N;#P ＜0.05 vs DM;△P ＜0.05 vs DM+CM;▲P ＜0.05 vs ATO1;◆P ＜0.05 vs ATO2.圖1 各組大鼠SCr、CCr、BUN 及24 h-UAER 水平比較

3 病理形態(tài)學(xué)改變

如圖2 所示，CI-AKI 的病理變化主要在髓質(zhì)區(qū)。與N 組和DM 組比較，DM +CM 組髓質(zhì)區(qū)出現(xiàn)較多的小管上皮細(xì)胞脫落、壞死，炎癥浸潤(rùn)及空泡樣改變，部分管腔出現(xiàn)蛋白管型、細(xì)胞管型，甚至閉塞變形;ATO2 及ATO3 組與DM+CM 組比較，上述病理改變明顯減輕。與N 組和DM 組比較，DM +CM 組病理評(píng)分均高于前兩者(P ＜0.05);與DM+CM 組、ATO1 組和ATO2 組比較，ATO3 病理評(píng)分較三者低(P ＜0.05);而ATO1 與DM +CM 組評(píng)分未見明顯差異(P ＞0.05)。

Figure 2. Analysis of histological changes in each group (HE staining，×200). A:N;B:DM;C:DM + CM;D:ATO1;E:ATO2;F:ATO3. ▲:protein casts;↑:tubular vacuolar degeneration;△:infiltration of inflammatory cells and cell casts. Mean±SD.n=4. * P ＜0.05 vs A;#P ＜0.05 vs B;△P ＜0.05 vs C;●P ＜0.05 vs D;◆P ＜0.05 vs E.圖2 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)改變及病理評(píng)分分析

4 TUNEL 法標(biāo)記的凋亡細(xì)胞水平

在顯微鏡下，細(xì)胞核呈棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞。N 組內(nèi)僅見個(gè)別陽(yáng)性細(xì)胞核;DM 組較N 組凋亡明顯增加;與N 組和DM 組比較，DM+CM 組可見大量棕黃色凋亡細(xì)胞核;阿托伐他汀能明顯抑制小管上皮細(xì)胞凋亡，不同濃度的阿托伐他汀干預(yù)后凋亡細(xì)胞明顯減少，中濃度阿托伐他汀組的晚期凋亡細(xì)胞較DM+CM 組明顯減少，高濃度阿托伐他汀組中僅見少數(shù)凋亡細(xì)胞，見圖3。

Figure 3. Analysis of TUNEL-positive apoptotic tubular epithelial cells in each group (×400). A:N;B:DM;C:DM +CM;D:ATO1;E:ATO2;F:ATO3. Mean±SD. n=4. * P ＜0.05 vs A;#P ＜0.05 vs B;○P ＜0.05 vs C;●P ＜0.05 vs D;◆P ＜0.05 vs E.圖3 TUNEL 法檢測(cè)各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況

5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)

圖4、5 顯示，Bax 和Bcl-2 陽(yáng)性表達(dá)分別為棕黃色，Bax 和Bcl-2 在腎小管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜均有表達(dá)。N 組和DM 組Bcl-2 和Bax 表達(dá)均較低，DM組Bax 蛋白表達(dá)較N 組高，而Bcl-2 蛋白較N 組低;DM+CM 組Bax 蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較顯著增高，而Bcl-2 表達(dá)與對(duì)照組比較顯著降低(P ＜0.05);與DM+CM 組比較，Bcl-2 隨著阿托伐他汀劑量的升高表達(dá)增高(P ＜0.05)，而Bax 隨阿托伐他汀劑量的升高表達(dá)降低(P ＜0.05)，高濃度阿托伐他汀組較低劑量及中劑量阿托伐他汀組Bcl-2 表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，而Bax 表達(dá)明顯降低(P ＜0.05)。

Figure 4. Expression of Bax protein in each group (immunohistochemical staining，×200). A:N;B:DM;C:DM + CM;D:ATO1;E:ATO2;F:ATO3. Mean±SD. n=4. * P ＜0.05 vs A;#P ＜0.05 vs B;△P ＜0.05 vs C;▲P ＜0.05 vs D;◆P ＜0.05 vs E.圖4 免疫組化檢測(cè)各組大鼠腎臟Bax 蛋白表達(dá)

6 Western blotting 法檢測(cè)Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)

如圖6 所示，DM 組與N 組比較，Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯減少，Bax 蛋白表達(dá)明顯增多;與N 組和DM 組比較，CM+DM 組Bcl-2 蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax 蛋白表達(dá)上調(diào);與CM+DM 組比較，3 種劑量阿托伐他汀組Bcl-2 蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax 蛋白表達(dá)下調(diào)。而對(duì)于Bcl-2/Bax 比值，DM 組Bcl-2/Bax 比值明顯高于N 組(P ＜0.05);DM + CM 組Bcl-2/Bax 比值較N 組和DM 組明顯下降(P ＜0.05);與DM+CM 組比較，中劑量和大劑量阿托伐他汀組Bcl-2/Bax 比值升高，而小劑量阿托伐他汀組無(wú)顯著差異(P ＞0.05)。

Figure 5. Expression of Bcl-2 protein in in each group (immunocytochemical staining，×200). A:N;B:DM;C:DM +CM;D:ATO1;E:ATO2;F:ATO3. Mean±SD. n=4. * P ＜0.05 vs A;#P ＜0.05 vs B;△P ＜0.05 vs C;▲P ＜0.05 vs D;◆P ＜0.05 vs E.圖5 免疫組化檢測(cè)各組大鼠腎臟Bcl-2 蛋白表達(dá)

Figure 6. Western blotting analysis of Bcl-2 and Bax protein expression in each group. Mean±SD.n=4. * P ＜0.05 vs N;#P ＜0.05 vs DM;△P ＜0.05 vs DM+CM;▲P ＜0.05 vs ATO1;◆P ＜0.05 vs ATO2.圖6 Western blotting 法檢測(cè)各組Bax 和Bcl-2 蛋白的表達(dá)

討 論

目前CI-AKI 的發(fā)病機(jī)制尚未明確，有研究表明造影劑引起的缺血缺氧是CI-AKI 最主要機(jī)制之一。在含碘造影劑進(jìn)入腎血管后，腎血管血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)呈雙時(shí)相，首先是腎臟血管短暫性舒張和腎血流量增加階段，約持續(xù)20 min 后，腎血管進(jìn)入強(qiáng)烈痙攣性收縮階段，此過程可持續(xù)4 h 或者更久，引起超過50%的腎血流量急劇減少，從而造成髓質(zhì)缺血缺氧性損傷［5］。而作為CI-AKI 獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一的糖尿病可以加劇血管收縮，進(jìn)一步加重造影劑引起的髓質(zhì)局部灌注不足［3］。

CI-AKI 的缺血缺氧性損傷病理表現(xiàn)為髓質(zhì)區(qū)域的腎小管上皮細(xì)胞凋亡、壞死及小管塌陷，腎小管上皮細(xì)胞的線粒體腫脹，而體外條件下的腎小管細(xì)胞株，在加入對(duì)比劑后也可見明顯的線粒體酶活性及線粒體膜電位的改變［6］。Zager 等［7］的研究表明，含碘造影劑可以引起腎小管細(xì)胞的線粒體損傷。而在線粒體損傷后，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeabilty transition pore，MPTP)開放，使線粒體膜間隙內(nèi)的細(xì)胞色素C 大量釋放至胞質(zhì)中，最終誘導(dǎo)依賴及非依賴性天冬肽酶途徑激活的細(xì)胞凋亡［8］。線粒體外膜上的Bcl-2 家族蛋白，尤其是抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax 在MPTP 開放和關(guān)閉過程中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用;Lee 等［9］對(duì)糖尿病模型大鼠注射對(duì)比劑后，發(fā)現(xiàn)在髓攀升支粗段組織檢測(cè)到了凋亡標(biāo)志性DNA 片段，最終腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)程序性死亡。Yano 等［11］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，造影劑上調(diào)促凋亡基因bax mRNA 的表達(dá)，并下調(diào)抑凋亡基因bcl-2 mRNA 表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。此外，金可可等［11］發(fā)現(xiàn)，STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠可能通過誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞Bax 蛋白和抑制Bcl-2 蛋白表達(dá)，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。本研究通過凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 和Bax 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，糖尿病較對(duì)照組腎小管細(xì)胞凋亡增加，且Bcl-2/Bax 比值降低;而對(duì)比劑不僅促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，而且使Bcl-2 表達(dá)減少，Bax 表達(dá)增強(qiáng)，從而證實(shí)CI-AKI的發(fā)病可能與糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加有關(guān)，其機(jī)制可能與對(duì)比劑以及糖尿病干擾Bcl-2蛋白和Bax 蛋白表達(dá)作用有關(guān)。

目前，對(duì)凋亡研究的注意力集中在凋亡更早的過程，即一系列細(xì)胞內(nèi)具有關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)參與過程，Bcl-2 和Bax 涉及這一過程。在凋亡及其調(diào)控機(jī)制研究中，最主要的機(jī)制是Bcl-2 家族成員的參與。CI-AKI 屬于一過性的早期病理?yè)p傷性疾病，因此在損傷早期進(jìn)行相應(yīng)治療顯得尤為重要。CI-AKI的預(yù)防藥物的效果仍存在爭(zhēng)議，而基于他汀具有廣泛的心血管保護(hù)作用，包括改善血管內(nèi)皮功能、增加內(nèi)皮源性一氧化氮的生物利用度、抗氧化、抗炎癥等作用，他汀對(duì)CI-AKI 的預(yù)防作用受到極大關(guān)注及重視［12-14］。盡管有研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞、橫紋肌細(xì)胞凋亡［15-16］。但是有研究［17］提出阿托伐他汀可以減少腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，從而改善輸尿管梗阻引起的腎功能損害;Haylor 等［18］也證實(shí)，阿托伐他汀可通過抑制腎小管上皮細(xì)胞caspase-3 活化，發(fā)揮抗凋亡作用，進(jìn)而改善腎臟缺血再灌注損傷。這可能與阿托伐他汀的抗凋亡作用對(duì)不同細(xì)胞有選擇性。

本研究表明，阿托伐他汀可以上調(diào)Bcl-2 蛋白和下調(diào)Bax 蛋白表達(dá)水平，降低含碘造影劑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的凋亡率，并改善造影劑引起的腎功能的急性損害。這些結(jié)果提示他汀類藥物抑制對(duì)比劑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，可能與上調(diào)Bcl-2 蛋白和下調(diào)Bax 蛋白表達(dá)水平有關(guān)，從而發(fā)揮其腎臟保護(hù)作用。這一結(jié)論不僅與國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道一致，而且表明了他汀類藥物除抗炎、抗氧化應(yīng)激和改善血管內(nèi)皮功能等作用外，還有抑制對(duì)比劑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，與5 mg·kg-1·d-1以及10 mg·kg-1·d-1的阿托伐他汀治療組比較，30 mg·kg-1·d-1阿托伐他汀可明顯降低對(duì)比劑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡率，大鼠的腎功能以及Bcl-2/Bax 比值均有顯著改善。這提示在接受造影劑的介入治療或影像學(xué)檢查之前，負(fù)荷劑量他汀類藥物的強(qiáng)化治療可以使易患CI-AKI 的糖尿病高危人群的獲益最大。這一結(jié)論為我們?cè)谒☆愃幬镌缙凇⒍坛獭?qiáng)化治療預(yù)防CI-AKI提供了有力證據(jù)。

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