靶向泛素連接酶SIAH2 的shRNA 對人肝癌細胞株HepG2 細胞周期和凋亡的影響*

肖 海， 賀興波， 黃才斌， 劉 瑤△

(贛南醫學院1病理學教研室，2第一附屬醫院醫務科，3第一附屬醫院消化科，江西 贛州341000)

原發性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種全球高度惡性的腫瘤，大多數肝癌患者在發現癥狀時已處于病程的中晚期階段，錯過了手術治療的最佳時機［1］。我們前期研究發現:原發性肝細胞癌組織中檢測到泛素連接酶SIAH2(seven in absentia homolog 2)的高表達［2］。我們推測，SIAH2 可能是一個促進肝癌發生發展的癌基因。本研究利用RNA干擾技術抑制肝癌細胞中SIAH2 的表達，觀察其對HepG2 細胞增殖、周期和凋亡的影響，為以SIAH2 為靶標的肝癌基因治療提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 材料

人肝癌細胞株HepG2 由本室保存;pGenesil-SIAH2 重組質粒由本室前期構建;Lipofectamine 2000購自Invitrogen;RPMI-1640 培養液和胎牛血清購自Gibco;MTS 試劑盒購自Promega;Annexin V-PE/ 7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D，7-AAD)細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物發展技術有限公司;細胞周期檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。RNA 提取液購自武漢祥云博生物工程技術有限公司，cDNA 第1 鏈合成試劑盒、藍色預染PCR Mix以及DNA markerⅡ購自天根生化科技(北京)有限公司。兔抗人SIAH2 及GAPDH 單克隆抗體購自Santa Cruz;山羊抗兔IgG-HRP 購自武漢興華基因生物科技有限公司;ECL 為Pierce 產品。

2 方法

2.1 細胞培養及質粒瞬時轉染 HepG2 細胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基(含1 ×105U/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素)中培養，于37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養，每3d 傳代1 次。用去內毒素質粒純化試劑盒提取質粒pGenesil-SIAH2 和pGenesil-1，其含量和純度測定按分子克隆所述。通過Lipofectamin 2000 轉染處于對數生長期的HepG2細胞，每1 ×106個細胞轉染4 μg 質粒。轉染pGenesil-SIAH2 細胞的HepG2 細胞命名為HepG2-SIAH2細胞;未轉染任何質粒的HepG2 細胞為陰性對照;轉染空載體pGenesil-1 的HepG2 細胞命名為HepG2-neo 細胞;脂質體對照組命名為HepG2-Lipo 細胞。轉染后24 h 在倒置熒光顯微鏡觀察瞬時轉染各組細胞的熒光強度。

2.2 RT-PCR 檢測SIAH2 mRNA 的表達 提取轉染后72 h HepG2-SIAH2、HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細胞總RNA，按試劑盒要求逆轉錄合成cDNA。SIAH2(152 bp)上游引物5’-GAT CCA CAT GAA CGC ACG-3’，下游引物5’-GAG GGA AGC CAC GTG TAA AC-3’;內參照GAPDH(258 bp)上游引物5’-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3’，下游引物5’-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3’。PCR反應條件:94 ℃預變性2 min;94 ℃30 s，48 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 個循環，末次循環后72 ℃10 min反應結束，擴增產物于1 % 瓊脂糖凝膠電泳觀察。

2.3 Western blotting 檢測SIAH2 蛋白的表達 按試劑盒要求提取轉染后72 h HepG2-SIAH2、HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細胞總蛋白并定量。取40 μg 總蛋白變性5 min，進行12% SDS-PAGE 電泳，按照marker 切去需要的凝膠轉移至PVDF 膜上。用含10% 脫脂奶粉的TBS 4 ℃封閉過夜，加入特異性SIAH2 和GAPDHⅠ抗(濃度均為1∶1 000)，37 ℃孵育1 h;室溫TBST 漂洗4 次，每次15 min。Ⅱ抗(1∶2 000)37 ℃孵育1 h，室溫漂洗4 次，每次15 min。反應信號經化學熒光底物發光，X 線膠片曝光。

2.4 MTS 細胞增殖實驗 分別用0.25%胰蛋白酶消化并收集HepG2 細胞，調整細胞濃度為1 ×108cells/L，取100 μL/well 接種至96 孔板。脂質體轉染操作同前所述。HepG2-SIAH2、HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細胞分別在轉染后12 h、24 h、48 h 和72 h 將對應96 孔板換液并加入100 μL/well RPMI-1640 培養液及10 μL/well MTS。室溫、5% CO2及飽和濕度條件下培養4 h，酶標儀讀取A490數據。細胞生長抑制率(%)= (1 - 實驗孔A值/對照孔A 值)×100%。

2.5 細胞周期分析 分別用0.25%胰蛋白酶消化并收集轉染后48 h 的HepG2-SIAH2、HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細胞，調整細胞濃度為1 ×109cells/L;制備的單細胞懸液用體積分數為70%乙醇固定，4 ℃保存過夜，染色前用PBS 洗去固定液;加50 μL RNase A 37 ℃水浴30 min;再加200 μL PI 染色均勻，4 ℃避光30 min;上流式細胞儀檢測，記錄激發波長為488 nm 處紅色熒光。

2.6 細胞凋亡檢測 分別用0.25%胰蛋白酶消化并收集轉染后48 h 的HepG2-SIAH2、HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細胞，調整細胞濃度為1 ×109cells/L;加入200 μL Binding Buffer 懸浮細胞;加入5 μL Annexin V-PE 混勻后，加入5 μL 7-AAD混勻，室溫避光反應5 ～15 min;在1 h 之內上流式細胞儀檢測。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0 統計軟件，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較用單因素方差分析，以P ＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 熒光顯微鏡下觀察各組細胞轉染情況

HepG2 細胞瞬時轉染重組載體pGenesil-SIAH2和空載體pGenesil-1 24 h 后，均可見明顯的綠色熒光。脂質體組和未轉染任何質粒的HepG2 僅見到微弱的熒光，見圖1。

2 RT-PCR 檢測SIAH2 mRNA 表達水平

RT-PCR 結果顯示，HepG2-SIAH2 細胞SIAH2 mRNA 表達量(0.02 ±0.02)顯著低于正常HepG2 細胞(0.11 ±0.05)、HepG2-neo 細胞(0.13 ±0.04)和HepG2-Lipo 細胞(0. 12 ± 0. 01)(均P ＜0. 05)。HepG2-neo 細胞、HepG2-Lipo 細胞和正常HepG2 細胞之間，差異無統計學意義(P ＞0.05)，見圖2。

Figure 1. Detection of transfection efficiency by fluorescence microscopy (×200).圖1 熒光顯微鏡下觀察各組細胞的轉染效率

Figure 2. The expression of SIAH2 mRNA in each group after transfection. Mean ± SD. n =3. * P ＜0.05 vs other groups.圖2 各組細胞轉染后SIAH2 mRNA 相對表達量

3 Western blotting 檢測SIAH2 蛋白表達水平

Weatern blotting 結果顯示，HepG2-SIAH2 細胞SIAH2 蛋白表達量(0.68 ± 0.01)顯著低于正常HepG2 細胞(1.09 ±0.02)、HepG2-neo 細胞(1.05 ±0.04)和HepG2-Lipo 細胞(1.04 ± 0.04)(均P ＜0.05)。HepG2-neo 細胞、HepG2-Lipo 細胞和正常HepG2 細胞之間，差異無統計學意義(P ＞0.05)，見圖3。

Figure 3. The expression of SIAH2 protein in each group after transfection. Mean ± SD. n =3. * P ＜0.05 vs other groups.圖3 各組細胞轉染后SIAH2 蛋白相對表達量

4 pGenesil-SIAH2 抑制HepG2 細胞的增殖

用MTS 比色法檢測各組細胞轉染后12 ～72 h的生長情況，發現pGenesil-SIAH2 轉染組細胞增殖速度較其它各組明顯減慢，各時點吸光度值明顯低于HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細胞(P ＜0.05)。HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細胞之間差異無統計學意義(P ＞0.05)。轉染pGenesil-SIAH2 24 h 細胞吸光度值開始下降，細胞增殖抑制率為36.3% ±2.3%;48 h 抑制效果最明顯，抑制率為55.2% ±4.2%;48 h 后抑制效應減弱，增殖速度有所提高，但仍低于其它各組;72 h 細胞抑制率為51.1% ±1.2%，各時點吸光度值見表1。

5 pGenesil-SIAH2 對HepG2 細胞周期的影響

流式細胞術檢測各組細胞周期的變化，與HepG2 細胞［G1期(44.62 ±0.23)%，S 期(25.66± 0.16)%］、HepG2-neo 細 胞［G1期(46.87 ±0.12)%，S 期(25.71 ±0.87)%］和HepG2-Lipo 細胞［G1期(45.29 ±0.35)%，S 期(25.92 ±0.66)%］相比較，HepG2-SIAH2 細胞G1期細胞顯著增多，S 期細胞顯著減少［G1期(49.68±0.25)%，S 期(22.94 ±0.66)%］，細胞明顯阻滯于G1期(P ＜0.05)，見圖4。

表1 MTS 法檢測pGenesil-SIAH2 轉染對HepG2 細胞增殖的影響Table 1. Effects of pGenesil-SIAH2 transfection on the proliferation of HepG2 cells measured by MTS assay(Mean±SD.n=3)

Figure 4. The cell cycle of HepG2 cells measured by flow cytometry. A:HepG2;B:HepG2-neo;C:HepG2-Lipo;D:HepG2-SIAH2.Mean±SD.n=3. * P ＜0.05 vs other groups.圖4 流式細胞術檢測各組細胞細胞周期的變化

6 pGenesil-SIAH2 對HepG2 細胞凋亡的影響

Annexin V-PE/7-AAD 流式細胞術可將實驗樣本中的正常、早期凋亡、晚期凋亡和壞死細胞區分開來，即左下象限(LL)為活細胞(Annexin V-/7-AAD-)，右下象限(LR)為早期凋亡細胞(Annexin V+/7-AAD-)，右上象限(UR)為晚期凋亡和壞死細胞(Annexin V+/7-AAD+)。流式結果顯示，與HepG2、HepG2-neo 和HepG2-Lipo 組相比，HepG2-SIAH2 組早期凋亡率明顯增高，差異顯著(P ＜0.05)。HepG2、HepG2-neo 和HepG2-Lipo 組之間，差異無統計學意義(P ＞0.05)，見圖5。

討 論

泛素化修飾是近幾年在細胞內發現的一種與磷酸化作用相似的蛋白質翻譯后修飾方式，與細胞生命活動、神經系統退行性變、免疫應答、炎癥反應均有著密切的關系，特別在精細調控細胞周期，抑制或促進細胞凋亡以及激活轉錄因子的表達等方面發揮了重要作用，是蛋白質發揮功能的重要調節機制之一［3］。泛素化修飾主要發生在賴氨酸殘基的側鏈，其過程是在泛素激活酶E1 和泛素結合酶E2 協同下，泛素連接酶E3 募集特異的靶蛋白和E2，并介導泛素與靶蛋白共價結合，形成多聚泛素鏈，26S 蛋白酶體隨后識別并降解帶有多聚泛素鏈的靶蛋白［4］。E3 泛素連接酶也可以通過單泛素化方式修飾靶蛋白，調節靶蛋白功能。當E3 發生功能性突變時，其對靶蛋白的調控能力喪失可引起癌蛋白聚集、抑癌蛋白異常降解、細胞凋亡受阻或/和增殖加速，從而導致腫瘤的發生發展［5-6］。

Figure 5. The apoptotic rate of HepG2 cells detected by flow cytometry. A:HepG2;B:HepG2-neo;C:HepG2-Lipo;D:HepG2-SIAH2.Mean±SD.n=3. * P ＜0.05 vs other groups.圖5 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率的變化

SIAH 是在哺乳動物中發現的一種E3 泛素連接酶家族成員，其C 末端為底物結合域(substrate binding domain，SBD)，中間由2 個高度保守的的鋅指結構域組成，N 末端含有40 ～80 個氨基酸殘基和典型的環指結構域(ring finger domain)。人類SIAH2定位于染色體3q25，編碼324 個氨基酸［7］。研究發現:胰腺癌和肺癌組織的中檢測到SIAH2 高表達，且SIAH2 的表達水平與腫瘤的臨床病理分期和分化程度相關;SIAH2 在BxPC3、Panc-1 等胰腺癌細胞及BZR、A549 等肺癌細胞中有高表達;抑制SIAH2 可顯著抑制人胰腺癌或肺癌裸鼠皮下移植瘤的生長［8-9］。功能結構域缺陷的SIAH2 或SIAH2 的RNA干擾載體可降低磷酸化ERK 的活性，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡［10］。我們的前期研究發現:SIAH2在肝癌組織中的表達陽性率高于相應癌旁組織，差異有統計學意義。SIAH2 表達水平與肝癌患者TNM分期具有相關性，與患者的性別、年齡、甲胎蛋白水平、腫瘤大小、血清HBsAg(hepatitis B surface antigen)水平和是否伴隨肝硬化不存在相關性［2］。上述研究結果提示，SIAH2 可能作為一個癌基因，在肝癌發病過程中發揮了重要作用。

本研究中，我們將前期篩選到的特異性靶向SIAH2 的RNA 干擾載體pGenesil-SIAH2 轉染HepG2細胞，RT-PCR 和Western blotting 結果證實SIAH2 mRNA 和蛋白表達水平顯著下調。MTS 結果顯示轉染pGenesil-SIAH2 的HepG2 細胞生長受到抑制。采用流式細胞術分析RNA 干擾對HepG2 細胞的增殖和細胞周期的影響，結果顯示pGenesil-SIAH2 轉染48 h 后，G1期細胞比例明顯高于其它組，提示沉默SIAH2 基因可阻止G1期細胞進入S 期，造成G1期細胞聚集，S 期細胞減少，從而抑制HepG2 細胞增殖［11］。

在凋亡的早期階段，分布在細胞膜脂質雙層內側的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)由脂膜內側翻向外側，從而被PS 特異的Annexin V 探針所標記。將Annexin V 進行熒光素PE 標記，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生［12］。核酸染料7-AAD 對細胞膜完整的活細胞和早期凋亡細胞是拒染的，而對膜完整性被破壞的晚期凋亡細胞或壞死細胞可以染色。因此，Annexin V-PE 結合7-AAD 雙染后，流式細胞術檢測結果呈現3 個細胞群，即左下象限(LL)正常細胞、右下象限(LR)早期凋亡細胞和右上象限(UR)晚期凋亡和壞死細胞。在本研究中，我們發現HepG2-SIAH2 細胞早期凋亡率較其它各組明顯升高。雖然凋亡早期細胞膜的完整性未遭到破壞，但胞內早已啟動了凋亡機制，比如線粒體膜電位的喪失、細胞色素C 進入胞漿、細胞內鈣離子濃度升高以及啟動蛋白水解酶層疊級聯反應等。凋亡晚期階段，細胞在蛋白水解酶等凋亡效應分子的作用下，胞膜完整性遭到破壞，細胞皺縮，染色質濃縮，DNA 裂解為長度不等的片段(180 ～200 bp 整倍數)，最后形成由細胞膜包裹的凋亡小體并被其它細胞所吞噬。細胞處于壞死階段時，細胞腫脹直至破裂并釋放出內含物，常引起炎癥反應。因此，相對于晚期凋亡和壞死而言，早期凋亡能更靈敏地體現凋亡誘導因素作用下，細胞內部發生的一系列分子生物學事件。

綜上所述，利用RNA 干擾技術下調SIAH2 基因表達后，HepG2 細胞生長速度減慢，增殖受抑且凋亡率增加。接下來我們將建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，探討SIAH2 作為肝癌基因治療靶點的可行性，為進一步闡明SIAH2 的分子生物學功能及其與肝癌發病的相關性，研制高效、特異的新型抗腫瘤藥物提供實驗依據。

［1］ Bosch FX，Ribes J，Cleries R，et al. Epidemiology of hepatocellular carcinoma［J］. Clin Liver Dis，2005，9(2):191-211.

［2］ 劉 瑤，廖躍光，黃才斌，等. 肝細胞癌組織中PEG10、SIAH2 的表達及其意義［J］. 臨床與實驗病理學雜志，2012，28(4):371-373.

［3］ 楊 娜，侯巧明，南 浩，等. 泛素連接酶的結構與功能研究進展［J］. 生物化學與生物物理學進展，2008，35(1):14-20.

［4］ 楊東葉，劉凱于，余澤華. 泛素連接酶E3［J］. 細胞生物學雜志，2005，27(3):281-285.

［5］ 倪曉光，趙 平. 泛素-蛋白酶體途徑與惡性腫瘤關系的研究進展［J］. 中華腫瘤防治雜志，2007，14(19):1512-1519.

［6］ Confalonieri S，Quarto M，Goisis G，et al. Alterations of ubiquitin ligases in human cancer and their association with the natural history of the tumor［J］. Oncogene，2009，28(33):2959-2968.

［7］ Wen YY，Yang ZQ，Song M，et al. SIAH1 induced apoptosis by activation of the JNK pathway and inhibited invasion by inactivation of the ERK pathway in breast cancer cells［J］. Cancer Sci，2010，101(1):73-79.

［8］ Schmidt RL，Park CH，Ahmed AU，et al. Inhibition of RAS-mediated transformation and tumorigenesis by targeting the downstream E3 ubiquitin ligase seven in absentia homologue［J］.Cancer Res，2007，67(24):11798-11810.

［9］ Ahmed AU，Schmidt RL，Park CH，et al. Effect of disrupting seven-in-absentia homolog 2 function on lung cancer cell growth［J］. J Natl Cancer Inst，2008，100(22):1606-1629.

［10］M?ller A，House CM，Wong CS，et al. Inhibition of Siah ubiquitin ligase function［J］. Oncogene，2009，28(2):289-296.

［11］余海浪，劉安玲，周玨宇，等. 靶向COLIA1 基因的shRNA 對人乳腺癌MDA-MB-231 細胞增殖與凋亡的影響［J］. 中國病理生理雜志，2012，28(12):2182-2186.

［12］劉曉兵，郭曉紅，劉立新，等. siRNA 沉默Smad3 對肝星狀細胞增殖與凋亡的影響及其機制研究［J］. 中國病理生理雜志，2011，27(7):1376-1381.