大黃素阻抑人乳腺癌MCF-7 細胞增殖和細胞周期進程*

李夢佳， 馬蓮順， 楊亞萍， 朱瑋瑋， 陳麗新， 王立偉， 朱林燕△， 楊海峰

(暨南大學1醫學院藥理學系，2分析測試中心，3醫學院生理學系，廣東 廣州510632;4廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東省中醫院病理科，廣東 廣州510120)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，近年來我 國乳腺癌發病率增高，逐漸成為嚴重威脅女性健康的嚴重疾病。乳腺癌的治療手段以手術和化療為主，然而腫瘤對傳統的細胞毒性化療藥物產生耐藥從而導致化療失敗是目前乳腺癌藥物治療較為突出的問題。大黃素(emodin)是從中藥材大黃中提取的一種天然的蒽醌類衍生物，是大黃、虎杖、何首烏等多種中藥的有效活性成分。大黃素因其多重的生物學活性(如血管舒張、免疫抑制、保護肝臟、抗腫瘤作用)，得到廣泛的關注［1］。大黃素對多種腫瘤細胞的增殖均有顯著的抑制作用，如人肺癌A549 細胞、髓系白血病HL-60 細胞、肝癌SMMC-7721 細胞等，是一種潛在的抗腫瘤藥物［2-4］。但國內鮮有大黃素抗乳腺腫瘤方面的報道。本實驗以人乳腺癌MCF-7 細胞為研究對象，通過流式細胞術檢測用藥后腫瘤細胞周期及凋亡的變化情況，并采用原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)觀察細胞膜超微結構的改變來研究大黃素的抗腫瘤作用，從而為大黃素治療乳腺癌的臨床應用提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 主要藥物、試劑和儀器

大黃素(廣東省食品藥品檢驗所);MTT(sigma);DMEM 培養基(Gibco)，10% 胎牛血清(Gibco);Annexin V-PI 凋亡試劑盒(南京凱基生物科技有限公司);AFM(BioScope Catalyst ScanAsyst，Bruker);流式細胞儀(FACS Aria，BD)。

2 方法

2.1 細胞培養 將MCF-7 接種于含10%胎牛血清、青霉素(1 ×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)的DMEM 培養基中，置5%CO2、37 ℃的孵箱中常規培養，細胞貼壁生長，每3 d 傳代。用0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸消化，收集對數生長期細胞進行實驗。

2.2 MTT 法檢測大黃素對MCF-7 細胞增殖的影響

取對數生長期的細胞，按每孔4 ×103個接種96 孔培養板，37℃、5%CO2培養箱中培養16 ～18 h 后，加入不同濃度的大黃素(μmol/L):0、6.25、12.5、25、50和100，每組均設6 個復孔。37 ℃、5%CO2培養48 h加入MTT (終濃度0.5 g/L)，置于37 ℃繼續培養4 h。棄培養基，每孔加DMSO 100 μL，水平搖床振蕩使細胞內藍紫色結晶充分溶解。10 min 后酶標儀上測定570 nm 波長處的吸光度(A570)。按以下公式計算大黃素對腫瘤細胞的殺傷作用，細胞生長抑制率(%)=(1 -加藥組細胞A 值/對照組細胞A 值)×100%，繪制量效曲線并計算IC50值。

2.3 細胞周期變化及凋亡率的檢測 采用流式細胞術分析。設定空白組和大黃素組，收集經大黃素作用48 h 后的MCF-7 細胞，PBS 緩沖液洗滌2 次，離心去上清，加入4 ℃預冷的95%乙醇，4 ℃固定過夜，離心后棄上清液，PBS 洗1 次，加PI 染色劑避光染色15 ～20 min，用流式細胞術檢測細胞周期各時相的變化及凋亡率。

2.4 Annexin V/PI 雙染法檢測細胞凋亡率 設定空白組和大黃素組，48 h 后收集MCF-7 細胞，PBS 緩沖液洗滌2 次(4 ℃)，按照試劑盒的說明加入Annexin V-FITC，混勻室溫避光孵育10 min，離心重懸后加入PI，用流式細胞術分析。細胞凋亡率(%)=Annexin V+PI-細胞百分比+Annexin V+PI+細胞百分比。

2.5 AFM 樣品制備及成像 取對數生長期細胞，用培養液調整細胞濃度為1 ×108/L，接種于6 孔培養板中，置于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h 后，設定空白組、大黃素組，48 h 后用PBS 洗滌MCF-7 細胞并重懸，滴于玻片上，自然鋪展，吸附2 h。后用pH 7.4 PBS 緩沖液沖洗，用1% 戊二醛溶液固定15 min，用蒸餾水沖洗3 次，室溫自然晾干后上機觀察。利用Olympus 倒置顯微鏡觀察細胞的分散情況，用AFM 對樣品進行掃描成像。通過測量細胞核高度，反映經藥物作用后細胞核是否發生坍塌腫脹等變化，并利用Nanoscope Analysis 軟件分析細胞膜表面的粗糙程度，反映細胞膜超微結構的變化。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0 統計分析軟件處理。數據以均數±標準差(mean ±SD)表示，組間均數比較采用方差分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 大黃素抑制MCF-7 細胞增殖

48 h 后對照組每孔細胞大約鋪滿80%，細胞成團生長，分布均勻，狀態良好。大黃素呈劑量依賴性抑制MCF-7 細胞增殖，當藥物濃度為12.5 μmol/L時，生長抑制率為(13.65 ±0.36)%，與對照組相比差異顯著(P ＜0.05)，當藥物濃度為100 μmol/L，生長抑制率高達(74.61 ±3.63)%。非線性回歸分析得出大黃素對MCF-7 細胞增殖抑制的IC50值為50.55 μmol/L，見圖1B，因此選用大黃素濃度50 μmol/L 進行后續實驗。

Figure 1. Effects of emodin on the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells (MCF-7). A:effect of emodin on the viability of MCF-7 cells;B:inhibition of MCF-7 cell proliferation by emodin.Mean±SD. n=3. * P ＜0.05 vs 0 μmol/L.圖1 大黃素對MCF-7 細胞增殖的影響

2 大黃素阻抑MCF-7 細胞于G0/G1 期

流式細胞術檢測結果表明大黃素可阻抑MCF-7細胞于G0/G1期(圖2)，MCF-7 細胞經50 μmol/L 大黃素作用48 h 后，G0/G1期細胞數量達(73.15 ±0.07)%，與對照組［(52.55 ±3.61)］%比較差異顯著(P ＜0.05)，見表1。而S 期的細胞數量僅(15.95±2.76)%，與對照組［(35.65 ±6.71)%］比較f 顯著降低(P ＜0.05)。此外，圖2 中G0/G1期峰前并沒有明顯的亞峰，提示大黃素可能對MCF-7 細胞凋亡的影響較小。

Figure 2. Effects of emodin on the cell cycle distribution of MCF-7 cells.A:control;B:emodin (50 μmol/L).圖2 大黃素對MCF-7 細胞周期分布的影響

表1 大黃素阻滯MCF-7 細胞周期于G0/G1 期Table 1. Emodin induced cell cycle arrest at G0/G1 phase (%.Mean±SD.n=3)

3 大黃素對MCF-7 細胞凋亡的影響

進一步用Annexin V/PI 雙染法檢測大黃素是否可誘導MCF-7 細胞的凋亡。50 μmol/L 大黃素作用48 h，細胞的凋亡率為(6.35 ±1.93)%，與對照組細胞［(3.46 ±2.23)%］相比無顯著差異，見圖3。

4 大黃素影響MCF-7 細胞膜的超微結構

應用AFM 掃描成像，獲得了各組單個細胞的超微形貌圖和三維結構圖。對照組的細胞鋪展的舒展，核區飽滿，膜表面平坦光滑，見圖3A、B;與對照組相比，50 μmol/L 大黃素作用48 h 后MCF-7 細胞形態明顯不同，細胞逐漸萎縮，偽足數量明顯減少，細胞核明顯坍塌，細胞表面粗糙，核區高度明顯降低，見圖3D、E;利用Nanoscope Analysis 軟件測量核區高度:對照組細胞的核高度顯著高于加藥組(P ＜0.05)，見圖3C、F。

Figure 3. Effect of emodin on the apoptosis of MCF-7 cells.A:control;B:emodin (50 μmol/L).圖3 大黃素對MCF-7 細胞凋亡的影響

Figure 4. AFM morphological images of MCF-7 cells treated with 50 μmol/L emodin for 48 h. A ～C:control;D ～F:50 μmol/L emodin. A，D:three-dimensional morphological images (60 μm ×60 μm);B，E:ultrastructure (2 μm ×2 μm);C，F:the height profiles at the lines indicated in A，D.圖4 大黃素對MCF-7 細胞膜超微結構的影響

為進一步探索大黃素對細胞膜超微結構的影響，通過Nanoscope Analysis 軟件測量得到三維結構參數值:細胞膜表面的平均粗糙度(average roughness，Ra)和均方粗糙度(root mean square roughness，Rq)。大黃素組的細胞表面褶皺增多，粗糙度明顯增大，其Rq［(50.12 ± 11.11)nm］和Ra ［(40.61 ±9.30)nm］，與對照組的Rq［(29.39 ±6.09)nm］和Ra［(22.51 ± 4.64)nm］比較有顯著差異(P ＜0.05)，見表2。

表2 大黃素對MCF-7 細胞膜超微結構的影響Table 2. Ultrastructural parameters of MCF-7 cells treated with emodin (nm.Mean±SD.n=9)

討 論

大黃素是從大黃中提取的一種天然的蒽醌類衍生物，是蓼科大黃屬植物的根及根狀莖中的活性成分，也是大黃中的主要有效成分，其藥理作用廣泛［5］。近年來，大黃素在誘導腫瘤細胞凋亡、影響腫瘤細胞生長周期和抑制腫瘤轉移中的作用受到關注。Kawai 等［6］首先發現大黃素能夠抑制小鼠白血病L1210 細胞的生長，隨后發現大黃素對多種腫瘤細胞的增殖均有抑制作用，但其抗腫瘤的機制并不相同。

本實驗通過流式細胞術檢測用藥后腫瘤細胞周期及凋亡情況，并采用AFM 觀察大黃素對細胞膜超微結構的影響，結果表明大黃素對人乳腺癌MCF-7細胞的增殖有明顯的抑制作用，并且隨著濃度的增加，抑制作用增強，存在一定的量效關系。有文獻報道，大黃素通過將人胃癌SCG-7901 細胞阻滯于G2/M 期并誘導其凋亡來發揮其抗腫瘤作用［7］，而對于人結腸癌HT-29 細胞，大黃素則將其細胞周期阻滯于S 期來發揮其抗腫瘤作用［8］。進一步探討大黃素抑制MCF-7 細胞增殖的機制發現，大黃素可阻抑MCF-7 細胞的細胞周期于G0/G1期，而Annexin V/PI 雙染結果顯示大黃素對MCF-7 細胞無明顯誘導凋亡的作用。以上實驗結果表明大黃素主要通過影響細胞周期從而抑制MCF-7 細胞的增殖。

AFM 具有高分辨率、高靈敏度的優點，近年來原子動顯微鏡亦用于腫瘤細胞的成像研究，可作為檢測腫瘤細胞的凋亡以及評估抗腫瘤藥物療效的工具。本實驗通過AFM 觀察大黃素對MCF-7 細胞超微形貌的影響，進一步在單細胞水平上明確大黃素是否具有抗腫瘤作用。結果顯示，大黃素作用后，細胞逐漸萎縮，核區發生明顯坍塌。細胞周圍的絲狀偽足也開始減少，說明大黃素作用于細胞后，可能干擾了細胞的侵襲作用，減弱了細胞間的信息傳遞。而且大黃素作用后，細胞膜表面的粗糙度與對照組相比明顯增加。粗糙度是細胞形貌的超微結構重要參數之一，已證實細胞表面粗糙度的大小與細胞骨架的完整性及細胞表面糖基蛋白等變化相關［9］，我們推測粗糙度的增加可能是藥物作用于細胞膜表面分子，使細胞的骨架發生重排，導致細胞呈現不同的形貌，而這些形貌變化又與細胞黏附、增殖等特性密切相關［10-12］。通過AFM 得到的數據在納米級水平上為揭示細胞的生理病理狀態提供了可視化依據，同時為實現通過單細胞診斷癌癥提供有用的數據支持。

我們的實驗表明，大黃素可通過影響細胞周期、破壞細胞膜超微結構而對人乳腺癌MCF-7 細胞有顯著的殺傷作用，為臨床應用大黃素治療乳腺癌提供實驗依據。

［1］ Wang S，Chen T，Chen R，et al. Emodin loaded solid lipid nanoparticles:Preparation，characterization and antitumor activity studies［J］. Int J Pharm，2012，430(1-2):238-246.

［2］ 邵 勤，官 陽，楊木蘭，等. 大黃素抑制PDGF 誘導的肝癌細胞增殖［J］. 中華腫瘤防治雜志，2007，14(7):514-517.

［3］ 廖子君，宋永春，陳曉泉. 大黃素對人肺腺癌A-549 細胞增殖周期影響的實驗研究［J］. 中華腫瘤防治雜志，2007，14(5):342-344.

［4］ 范仁根，田力平，錢海鑫，等. 大黃素對人肝癌細胞smmc-7721 的作用及機制［J］. 中華實驗外科雜志，2005，22(7):881.

［5］ 劉 薇，王一飛，劉中秋. 大黃素在人肝腸微粒體的葡萄糖醛酸化反應［J］.中國病理生理雜志，2012，28(9):1681-1685.

［6］ Kawai K，Kato T，Mori H，et al. A comparative study on cytotoxicities and biochemical properties of anthraquinone mycotoxins emodin and skyrin from Penicillium islandicum sopp［J］. Toxicol Lett，1984，20(2):155-160.

［7］ 劉貴忠，楊文修，王新宇，等. 大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸誘導腫瘤細胞凋亡的信號轉導通路［J］.哈爾濱師范大學自然科學學報，2004，20(4):95-98.

［8］ 曹燕亞，左文英，張 俊，等.大黃素對人結腸癌HT-29細胞體外增殖的抑制作用［J］.上海中醫藥雜志，2012，46(9):81-84.

［9］ Stolz M，Gottardi R，Raiteri R，et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy［J］.Nat Nanotechnol，2009，4(3):186-192.

［10］Li QS，Lee GY，Ong CN，et al. AFM indentation study of breast cancer cell［J］. Biochem Biophys Res Commum，2008，374(4):609-613.

［11］陳 勇，蔡繼業，邢少璟，等.多種腫瘤細胞表面超微結構的原子力顯微鏡觀察及藥物對細胞膜表面超微結構影響的初步研究［J］.電子顯微學報，2003，22(2):100-104.

［12］柳佳利，王 珣，林 熙，等.原子力顯微鏡觀察青蒿琥酯對人胃癌細胞株SCG-7901 膜表面形貌的影響［J］.中國病理生理雜志，2012，28(6):974-979.