紫杉醇聯合順鉑化療對人卵巢漿液性囊腺癌組織occludin 和ZO-1 表達以及線粒體超微結構的影響*

譚樹芬， 楊宏英， 李 凡， 魏向群， 李樹清△

(昆明醫科大學1第三附屬醫院婦瘤科，2病理生理教研室，云南 昆明650118)

卵巢漿液性囊腺癌(serous cystadenocarcinoma，SC)是最常見的卵巢上皮惡性腫瘤，約占全部卵巢腫瘤的40%，占卵巢上皮性癌的50% ～60%。當前，鉑類藥物對卵巢癌仍然是最重要的化療藥物［1-2］。新近研究發現，緊密連接(tight junction，TJ)膜蛋白結構的缺失可能是導致細胞黏附能力丟失和腫瘤轉移的關鍵步驟［3-4］，其在卵巢惡性腫瘤表達的差異可能成為卵巢癌診治的標志物［1］。TJ 的occludin 和zonula occludens-1 (ZO-1)蛋白是控制內皮或上皮細胞之間連接的關鍵物質，具有維持細胞極性、黏附性、運動性、調節細胞增殖及分化的功能［5］，盡管紫杉醇聯合鉑類是迄今認為最有效的化療方案，但其對SC 細胞occludin 和ZO-1 表達的作用尚不清楚。本文旨在觀察紫杉醇聯合順鉑化療對SC 細胞occludin 及ZO-1 表達的影響。

材 料 和 方 法

1 對象

20 例卵巢癌組織石蠟標本，取自昆明醫科大學第三附屬醫院婦瘤科2009 年～2012 年間行卵巢癌切除術的患者，年齡30 ～70 歲。分組原則:對于手術治療無困難的卵巢腫瘤患者，住院后直接實施手術治療。若手術治療困難的患者，先行B 超引導穿刺活檢，當確診為卵巢癌后進行化療，待腫瘤體積縮小后再行手術切除。石蠟標本均制成厚約4 μm 的連續組織切片2 份，其中一份進行HE 染色和病理組織學檢查，另一份標本進行免疫組化染色。以3 例知情同意后的子宮肌瘤患者的卵巢組織作為正常對照組。化療方案:紫杉醇加鉑類化療，具體為紫杉醇按175 mg/m2，鉑類選擇順鉑，按70 mg/m2靜滴。

2 方法

2.1 電子顯微鏡觀察 將患者術中切除的卵巢及時取組織塊，置于3.5%戊二醛內保存，磷酸鹽緩沖液沖洗后，丙酮酸逐級脫水，1%四氧鋨酸固定24 h，超薄切片機半薄切片定位，再作檸檬酸鉛醋酸鈾雙染色，在JEM-1011 型電子顯微鏡下進行常規形態學觀察。

2.2 緊密連接蛋白的免疫組化檢測 采用免疫組化MaxVision 快捷法進行occludin 及ZO-1 檢測。操作步驟:常規固定包埋卵巢癌樣本，石蠟切片脫蠟、梯度乙醇脫水后，浸泡于蒸餾水中待用。組織高壓抗原修復:將水洗后的切片浸泡于0.01 mol/L 檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，在壓力鍋內加熱至沸騰(10 min);將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫染色架上，放入已沸騰的緩沖液內繼續加熱至工作溫度和工作壓力(噴汽)2 min 后，壓力鍋離開熱源。數分鐘后，沖淋冷卻蒸餾水沖洗2 次。3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，PBS 沖洗3 min ×3 次，非免疫小牛血清封閉抗原(10 min)，甩去血清，勿沖洗;用PBS(pH 7.4)沖洗3 min ×3 次，除去PBS 液，每張切片加50 μL 的第Ⅰ抗體(1∶100 稀釋)，4 ℃冰箱下孵育過夜。PBS 沖洗5 min ×3 次。除去PBS 液，每張切片加50 μL 酶標抗鼠/兔聚合物(Ⅱ抗)，室溫下孵育15 min。PBS 沖洗3 min ×3 次。除去PBS 液，每張切片加50 μL 新鮮配制的DAB 溶液，顯微鏡下觀察5 min。自來水沖洗，蘇木素復染，用0.1% HCl 分化，自來水沖洗返藍。切片經梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。采用正常卵巢組織(取自子宮肌瘤患者切除的卵巢組織)標本作為正常對照，以PBS 代替Ⅰ抗作為陰性對照。

2.3 免疫組化結果判定標準 所有石蠟切片由病理科醫師獨立評判后綜合評定。Occludin 和ZO-1 陽性物在細胞漿呈細顆粒狀棕黃色反應。在相同電壓及相同光亮度條件下，用20 倍物鏡攝取以上各區域的圖像傳送至計算機顯示屏，用Nikon-MiVnt 顯微圖像分析系統進行免疫組化圖像定量分析，所測得陽性細胞平均灰度值表示occludin 和ZO-1 陽性表達信號的相對強弱。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 11.5 統計軟件包，行單因素方差分析，方差齊性檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 化療對人卵巢SC 細胞線粒體超微結構的影響

電鏡觀察顯示，正常卵巢上皮細胞超微結構正常，形狀排列規則，線粒體未見異常。SC 細胞頂端可見小而粗短的微絨毛，以不規則的方式突向腔面，基底部細胞膜則多呈平滑狀，核位于基底部;線粒體明顯腫脹，位于細胞體部，呈現巨線粒體，且嵴斷裂十分顯著。化療后SC 細胞排列較規則，線粒體腫脹消失、線粒體體積明顯減小，形態接近正常，見圖1。

2 化療對人卵巢SC 組織緊密連接蛋白(occludin和ZO-1)表達的影響

免疫組化結果顯示，對照組卵巢上皮細胞occludin 和ZO-1 蛋白強表達，胞漿內有較多棕黃色陽性物，定位準確，表達清楚，背景清晰，胞核經蘇木素復染，呈藍黑色;SC 細胞occludin 和ZO-1 蛋白弱表達，胞漿內僅見少量棕黃色陽性物，藍黑色的胞核更加明顯，與對照組相比灰度值明顯升高(P ＜0.05 或P ＜0.01);化療組SC 細胞occludin 和ZO-1 表達增強，胞漿內有較多棕黃色陽性物，定位準確，表達清楚，背景清晰，胞核亦呈藍黑色，與SC 組相比灰度值明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)，見圖2。

Figure 1. Effects of paclitaxel-cisplatin combination chemotherapy on ultrastructural changes of human ovarian serous cystadenocarcinoma (SC)cells.圖1 化療對人卵巢SC 細胞超微結構的影響

Figure 2. Effects of paclitaxel-cisplatin combination chemotherapy on the expression of occludin and ZO-1 in human ovarian serous cystadenocarcinoma (SC)tissues (×200).Mean±SD. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs SC.圖2 化療對人卵巢SC 組織緊密連接蛋白表達的影響

討 論

卵巢癌是嚴重威脅婦女健康的常見疾病，由于其死亡率一直居高不下而成為當前國際腫瘤研究的重要領域。近年來，雖然化療方案的不斷完善與應用，但卵巢惡性上皮性腫瘤的療效卻未見明顯改善。卵巢癌的5 年生存率之所以總是徘徊于30% ～40%之間，其最重要的原因就是癌轉移之前的早期診斷十分困難。因此，開展卵巢癌發病規律、病理特點以及分子生物學的研究與探索具有極其重要的實踐意義，也是當前卵巢癌防治研究的重要領域。TJ 主要由跨膜蛋白和胞質附著蛋白組成。跨膜蛋白occludin 是第1 個被發現的TJ 蛋白［3］，其N 端對TJ 的裝配和屏障功能的保持起重要作用，C 端與ZO-1 直接相連，與ZO-1 共同調節緊密連接的結構變化，此特點對occludin 在TJ 間的定位及細胞間的通透性調節極其重要。ZO-1 是第1 個被證實的TJ 附著蛋白，它與occludin 位于胞質內的C 端直接相連［4，6］。TJ 中的occludin 和ZO-1 是控制物質穿過內皮和上皮細胞間連接的關鍵結構，具有維持細胞極性、黏附性、運動性、調節細胞增殖及分化的功能［3］。當組織惡變時，TJ 的功能異常可導致細胞極性破壞，表明TJ 蛋白可能是藥物靶向一種特殊分子。免疫組化研究顯示，SC 組織occludin 和ZO-1 表達明顯減弱，而化療組卵巢上皮細胞occludin 和ZO-1 表達明顯增強，可能是緩解細胞水腫及線粒體腫脹的關鍵所在。

國外學者認為，線粒體在順鉑抗腫瘤作用中具有的重要價值，因此將探索的注意力在集中到順鉑與線粒體的相互作用方面［1］。我們對SC 的超微結構觀察顯示，SC 線粒體腫脹和嵴斷裂的改變明顯。已證明，嵴型腫脹一般為可逆性，倘若膜損傷明顯加重時，可經過混合型腫脹而過渡為基質型腫脹。SC細胞的巨型線粒體可能是此型腫瘤惡性度較高的原因之一。化療組卵巢線粒體腫脹明顯減輕與occludin 和ZO-1 表達增強相平行，提示二者在保持卵巢的結構與功能中可能具有重要作用。TJ 在卵巢惡性腫瘤轉化中表達的不同特點有望成為卵巢癌診治的重要標志物［3］。已證明，腫瘤細胞暴露于順鉑最終導致細胞凋亡，僅1%的細胞內鉑可綁定到核DNA，而絕大多數細胞內的藥物可與其它分子相互作用，包括線粒體DNA［7-8］。Lee 等［9］的研究證實，卡鉑可使Bax 水平升高，而Akt 抑制劑則使Bax 水平下調，表明Akt 抑制劑可通過增加caspase-8 以及線粒體細胞色素C 的釋放而加強卡鉑對卵巢癌細胞的攻擊效應。鑒于大部分化療藥物作用于腫瘤細胞時都會產生活性氧而引起氧化應激［10］，其與TJ 蛋白表達以及線粒體信號轉導間的分子機制有待進一步研究。

(致 謝:本文統計學處理承蒙昆明醫科大學沈凌、陳靜老師大力協助，謹此致謝!)

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