干擾素誘導蛋白16 對人腦血管外膜成纖維細胞增殖與遷移的影響及其機制*

黃 晶， 宋 方， 龍向淑， 吳 強

(貴州省人民醫院心內科，貴州 貴陽550002)

血管重構是冠狀動脈介入治療術后再狹窄和高血壓等血管增殖性疾病的主要病理生理機制。既往認為血管外膜成纖維細胞(vascular adventitial fibroblasts，VAFs)在血管重構過程中作為“旁觀者”，僅僅起著支持與營養的作用。但近年來，越來越多的研究證明VAFs 的增殖、遷移與分泌細胞外基質等在血管重構過程中起著重要的作用［1］。將VAFs 作為治療靶點，有效地抑制其增殖、遷移對防治血管增殖性疾病有重要意義。干擾素誘導蛋白16(interferon-inducible protein 16，IFI16)是干擾素(interferon，IFN)誘導蛋白p200 家族的人源蛋白成員之一，具有抑制細胞增殖與促進細胞凋亡的作用［2］。有研究［3］發現，IFI16 蛋白可通過p53/p21 通路抑制臍靜脈內皮細胞增殖，但IFI16 對VAF 增殖、遷移等生物學功能的影響尚未見報道。本研究旨在誘導VAFs 上IFI16過表達和沉默其表達，觀察IFI16 對VAFs 增殖與遷移的影響，并探討其可能機制，為將IFI16 運用于治療血管增殖性疾病提供更多的理論依據。

材 料 和 方 法

1 材料

人腦血管外膜成纖維細胞(human brain vascular adventitial fibroblasts，HBVAFs)細胞株購自Scien-Cell;DMEM 高糖培養基和胎牛血清購自HyClone;p53 抗體和p21 抗體購自Epitomics;IFI16 抗體、βactin 抗體、IFI16 siRNA(h)、control siRNA-A、control siRNA(FITC-conjugated)-A、siRNA transfection medium 和siRNA transfection reagent 購自Santa Cruz;IFNα 購自北京三元基因工程有限公司;細胞周期與凋亡檢測試劑盒和SDS-PAGE 凝膠試劑盒購自碧云天公司;逆轉錄試劑盒購自Fermentas;real-time PCR 熒光染料試劑盒購自TakaRa;Transwell 小室購自Corning;PCR 擴增引物購自上海生工生物工程公司，見表1。

表1 引物序列Table 1. The sequences of primers

2 方法

2.1 HBVAFs 的培養 從液氮罐中取出細胞凍存管復蘇細胞。取復蘇后第3 ～4 代生長狀態良好的細胞用于實驗。

2.2 實驗分組 實驗分為6 組，即空白組、control siRNA 組和IFI16 siRNA 組，用2 ×106U/L IFN-α 分別處理各組24 h 后，即獲IFN-α +空白組、IFN-α +control siRNA 組和IFN-α+ IFI16 siRNA 組。

2.3 Real-time PCR 檢測mRNA 表達 取對數生長期細胞，按Trizol 法提取總RNA，按照RT-PCR 試劑盒說明書操作，逆轉錄條件:42 ℃60 min，70 ℃5 min。然后再按照熒光PCR 試劑盒說明書進行PCR 擴增。Real-time PCR 采用StepOnePlusTM系統(ABI)，反應條件:95 ℃30 s 預變性，95 ℃5 s，60 ℃34 s，重復循環40 次，熔解曲線分析95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。以β-actin 為內參照，2－ΔΔCt法計算各組IFI16、p53和p21 mRNA 的相對表達量。

2.4 Western blotting 檢測蛋白表達 按細胞裂解液(RIPA)說明書提取細胞蛋白。用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，置沸水煮5 min 變性蛋白質;電泳(IFI16 使用10%分離膠，p53 和p21 使用12%分離膠)，電壓80 V，進入濃縮膠后改為120 V。濕電轉膜，電流200 mA，轉膜時間1 h;5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;TBST洗膜3 次，每次10 min;Ⅰ抗4 ℃(IFI16 抗體、p53 抗體、p21 抗體和β-actin 抗體稀釋度分別為:1 ∶500、1∶1 000、1∶1 000 和1∶5 000)過夜孵育;TBST 洗膜3次，每次10 min ;37 ℃孵育Ⅱ抗1 h;TBST 洗膜3次，每次10 min;加入ECL 反應，印跡。用掃描儀掃描曝光膠片，BandScan 4. 3 軟件進行總灰度分析。以β-actin 為內參照，分析各組IFI16、p53 和p21 蛋白的相對含量。

2.5 流式細胞儀檢測細胞周期 按細胞周期與凋亡檢測試劑盒說明書操作進行細胞收集、染色后通過流式細胞儀進行DNA 含量分析。

2.6 細胞劃線法觀察細胞遷移 在12 孔板背后均勻畫出3 條橫穿過孔的線條，待孔內空白組、control siRNA 組和IFI16 siRNA 組細胞匯合度達90%以上后用劃線工具垂直于孔背面橫線劃痕。棄去孔內液體，并用PBS 液清洗2 遍。在另外上述3 組各孔內加入含2 ×106U/L IFN-α 的5%血清DMEM 培養基1 mL。顯微鏡下拍照后放入37 ℃、5% CO2培養箱。24 h 后取樣，拍照。計算遷移距離，遷移距離=劃痕0 h 后劃痕寬度－ 劃痕24 h 后劃痕寬度，以像素(pixel)作為長度單位。

2.7 Transwell 小室定量遷移細胞 取空白組、control siRNA 組和IFI16 siRNA 組對數生長期的細胞，消化細胞計數后，用含0.1 %胎牛血清DMEM 培養基重懸細胞至1 ×108/L。每個小室(上室)中加入100 μL 上述細胞懸液，在24 孔板內(下室)加入含10 %胎牛血清的DMEM 培養基800 μL，在另外的上述3 組上、下室內加入IFN-α，使之終濃度分別為2 ×106U/L。將24 孔板置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養24 h 后，棄孔內培養液，上室用PBS 液洗滌3 遍后，將小室置于4%多聚甲醛中固定20 min，后將其置于超凈臺中自然晾干。將小室置于0.1%結晶紫中染色20 min，再用PBS 液洗滌3 遍。晾干后，顯微鏡下隨機選取4 個視野，觀察細胞，并計數。

3 統計學處理

數據用均數±標準差(mean ±SD)表示，結果用SPSS 11.5 統計軟件進行單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 各組IFI16、p53 和p21 表達的變化

IFI16 siRNA 組中IFI16、p53 和p21 蛋白及mRNA 水平低于空白組(P ＜0. 05)，空白組與control siRNA 組間差異無統計學意義。在IFN-α 處理后，IFN-α+空白組、IFN-α +control siRNA 組和IFN-α +IFI16 siRNA 組中IFI16、p53 和p21 蛋白及mRNA 水平均高于空白組(P ＜0.05)。IFN-α +IFI16 siRNA組中IFI16、p53、p21 蛋白及mRNA 水平低于IFN-α+空白組(P ＜0.05)，IFN-α+空白組與IFN-α +control siRNA 組間IFI16、p53 和p21 差異無統計學意義，見圖1、表2。

Figure 1. Effects of IFI16 siRNA and IFN-α on the expression of IFI16，p53 and p21 proteins in HBVAFs.圖1 干預后IFI16、p53 及p21 蛋白在HBVAFs 中的表達情況

表2 干預后HBVAFs 中IFI16、p53 及p21 mRNA 表達情況Table 2. Effects of IFI16 siRNA and IFN-α on the expression of IFI16，p53 and p21 mRNA in HBVAFs (mean±SD.n=3)

2 各組細胞周期情況比較

IFI16 siRNA 組G0/G1期細胞低于空白組(P ＜0.05)，S 期細胞則高于后者(P ＜0.05)，空白組與control siRNA 組間差異無統計學意義。在IFN-α 處理后，IFN-α + 空白組、IFN-α + control siRNA 組和IFN-α+IFI16 siRNA 組中G0/G1期細胞高于空白組(P ＜0.05)，S 期細胞則低于后者(P ＜0.05)。IFN-α+ IFI16 siRNA 組中G0/G1期細胞低于IFN-α +空白組(P ＜0.05)，S 期細胞則高于后者(P ＜0.05)，IFN-α+空白組與IFN-α+control siRNA 組間差異無統計學意義，見圖2、表3。

Figure 2. Effects of IFI16 siRNA and IFN-α on cell cycle of HBVAFs.圖2 IFI16 siRNA 和IFN-α 對HBVAFs 細胞周期的影響

3 各組細胞遷移情況比較

IFI16 siRNA 組、空白組與control siRNA 組之間在細胞遷移數量與遷移范圍上差異無統計學意義。在IFN-α 處理后，IFN-α + 空白組、IFN-α + control siRNA 組和IFN-α+IFI16 siRNA 組細胞遷移數量與范圍均低于空白組(P ＜0.05)。IFN-α + IFI16 siRNA 組細胞遷移數量與范圍高于IFN-α +空白組(P＜0.05)，IFN-α + 空白組與IFN-α + control siRNA組間差異無統計學意義，見圖3、4、表3。

Figure 3. Effect of IFI16 siRNA on migration capability of HBVAFs.圖3 轉染IFI16 siRNA 后對HBVAFs 遷移的影響

Figure 4. Effects of IFN-α and IFI16 siRNA on migration capability of HBVAFs.圖4 轉染IFI16 siRNA 并加用IFN-α 處理對HBVAFs 遷移的影響

表3 IFI16 siRNA 和IFN-α 對HBVAFs 細胞周期與遷移的影響Table 3. Effects of IFI16 siRNA and IFN-α on cell cycle and migration of HBVAFs(mean±SD. n=3)

討 論

在血管重構過程中，VAFs 被激活，其增殖、分泌細胞因子及合成細胞外基質能力明顯增加;并表達α-平滑肌肌動蛋白，轉化為肌成纖維細胞，其中部分肌成纖維細胞遷移至內膜分泌細胞外基質，導致了晚期膠原纖維化，從而引起管腔狹窄［1］。由于VAFs在血管重構過程中起著至關重要的作用已經被視為血管增殖性疾病防治研究的重點之一。

IFN 是一組具有抗病毒、抗增殖、調節免疫應答等多種生物學效應的活性細胞因子家族［4-5］。研究［6-7］表明，局部轉染IFN-β 基因和腸外給予IFN-γ能抑制動脈球囊損傷后血管平滑肌細胞增殖和血管新生內膜形成，提示將IFN 應用于血管增殖性疾病的治療是可行的。然而IFN 的多種生物學效應與一系列被稱為干擾素誘導蛋白的蛋白有密切關系［4-5］。

IFI16 屬于IFN 誘導蛋白p200 家族的人源蛋白成員，其編碼基因位于人染色體1q21 ～23［8］。IFI16蛋白在人體多種器官組織如肝、子宮、泌尿生殖道、乳腺導管、皮膚的上皮細胞、淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞等有表達［9-10］。本研究發現，IFI16 在HBVAFs 也存在基礎表達，并能被IFN-α 誘導表達。前人通過體外實驗［2-3］發現增加IFI16 的表達能抑制細胞的增殖與遷移。而且將穩定轉染IFI16 基因的HNO163 頭頸部鱗狀細胞癌細胞與不表達IFI16 的HNO163 細胞分別注射于出生7 周的裸鼠，發現HNO163-IFI16 組形成的腫瘤明顯小于對照組，腫瘤內新生血管的合成也減少了［2］。本研究也發現單純下調IFI16 的表達雖然對HBVAF 遷移無明顯影響但能促進細胞G1/S 期轉換。而當IFN-α 誘導IFI16 表達增加后，VAF 的增殖指數下降，更多的細胞停滯在G0/G1期，在細胞周期進程受限的同時細胞遷移能力也隨之下降;但在成功瞬時轉染了IFI16 siRNA 的HBVAFs 中IFN-α 這一作用受到明顯限制，推測IFI16 可能是參與IFN-α 抑制VAF 增殖與遷移的機制之一，也進一步證實IFI16 表達具有抑制VAF 增殖與遷移的作用。

抑癌基因p53，能夠通過下游基因p21 抑制細胞周期進程，促進細胞凋亡與老化［4，11］，研究發現IFI16可通過p53/p21 與Rb/E2F1(同樣具有調控細胞周期功能)途徑抑制細胞增殖，但當抑制了p53 及Rb的表達及活性后，IFI16 抑制增殖的作用無法實現［3］。并且在前列腺癌細胞LNCaP(具有p53 與Rb功能)與PC-3(具有Rb 功能但無p53 功能)中分別過表達IFI16 蛋白后，細胞增殖抑制率也表現出明顯差異:LNCaP(＞90%)＞PC-3(50%)［8］。亦有實驗證實，在IFI16 蛋白氨基端上200A 結構域中MFHATVATIF 基序與p53 羧基端結合后，活化后者bax啟動子從而激活p53 表達，增加其下游目的基因p21表達［9］，另一個結構域200B 也能與p53 DNA-binding 的核心區域結合，從而起到穩定p53-DNA 復合體的作用［12］。前人的研究表明IFI16 在抑制細胞增殖過程中與p53 和p21 有密切關系。本研究結果顯示IFN-α 在誘導IFI16 表達增加的同時p53 與p21 的表達也上調了。而在沉默IFI16 基因后不但可下調HBVAFs 中p53 和p21 基線表達而且也抑制了IFNα 誘導的表達。在VAFs 中IFI16 與p53 和p21 一致的變化趨勢表明IFI16 抑制VAFs 增殖與遷移可能與促進p53 和p21 的表達有關。

綜上所述，在HBVAFs 中存在IFI16 的表達，后者具有抑制VAFs 增殖和遷移的作用;p53/p21 途徑可能參與該生物學效應的下游調控。

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