疏肝健脾方藥對NASH 大鼠Kupffer 細胞NF-κB p65 和IKKβ mRNA 及蛋白表達的影響*

韓 莉， 楊欽河， 楊雪松， 胡巢鳳， 張玉佩， 馮高飛， 王文晶，何秀敏， 王彥平， 程少冰， 金 玲， 閆海震， 黃 進

(暨南大學1附屬第一醫院，2醫學院中醫系，3醫學院組胚系再生醫學教育部重點實驗室，4醫學院病理生理學系、國家中醫藥管理局病理生理三級實驗室，廣東 廣州510632)

核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)是一種十分重要的核轉錄調控因子，在非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)動物模型和患者中，肝臟NF-κB 的表達顯著增加［1-2］，IκB 激酶β(IκB kinase β，IKKβ)是IκB 激酶復合體(IκB kinase，IKK)中的一個催化亞基，通過經典途徑激活NF-κB，參與免疫應答、炎癥反應等一系列病理生理過程［3］，實驗證明IKKβ 在NF-κB 信號通路活化過程中發揮重要的作用［4-5］。活化的NF-κB 通過信號轉導通路調控下游靶基因高表達，其產物參與肝臟的急慢性炎癥、肝纖維化、肝細胞再生和凋亡等病理生理過程［6］。NF-κB 的激活可能是肝臟和全身胰島素抵抗(insulin resistance，IR)的根源，參與NASH 的發病。因此，抑制IKKβ 和NF-κB mRNA 及蛋白的表達，可能成為有效防治NASH 的途徑之一。NASH 的發生發展的機制，目前尚不完全清楚，研究認為NASH 是一種遺傳、環境及代謝應激相關性疾病，其發病機制與IR、氧化應激、脂質過氧化等作用相關，其中從炎癥信號通路的研究成為近年研究的熱點。我們以往的研究發現［7-9］，疏肝健脾方藥可以抑制Kupffer 細胞ERK1/2 蛋白的表達，下調肝組織NFκB p65 蛋白的表達，下調IKKβ mRNA 和蛋白表達，從而具有良好的抗NASH 效果。本實驗實驗通過觀察大鼠Kupffer 細胞IKKβ 和NF-κB mRNA 及蛋白在疏肝健脾方藥干預后的變化，探討疏肝健脾方藥抗大鼠NASH 的分子機制，旨在闡明NASH 發病機制為臨床防治提供理論及實驗依據。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性SD 大鼠48 只，體重(200 ±20)g，購于廣州中醫藥大學實驗動物中心，動物許可證號為 SCXK (粵)2008-0020;粵監證字為2008A020。

1.2 實驗用藥

1.2.1 疏肝方( 柴胡疏肝散) 柴胡6 g，川芎5 g，枳殼5 g，陳皮6 g，白芍5 g，香附5 g，炙甘草3 g。

1.2.2 健脾方( 參苓白術散) 人參15 g，白術15 g，茯苓15 g，薏苡仁9 g，砂仁6 g，山藥15 g，桔梗6 g，白扁豆12 g，蓮子9 g，炙甘草9 g。

1.2.3 綜合方 柴胡疏肝散與參苓白術散合方。

1.3 主要試劑 Nycodenz 細胞分離液(No.1002424-1)購自瑞典Axis-shield;Ⅳ型膠原酶(No.C8160-100)購 自 Gbico;Anti-Lysozyme (No. bs-0816R)購自武漢博士德生物技術有限公司;Quant cDNA 第1 鏈合成試劑盒(No. KR103)、SYBR Green熒光定量PCR 試劑盒(No. FP202)購自北京天根生化有限公司;Anti-IKKβ(No.2684)和Anti-Phospho-IKKβ(No.9958)購自Cell Signaling Technology;Anti-NF-κB p65(No.sc-372)購自Santa Cruz;核蛋白提取試劑盒和BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

2 方法

2.1 動物分組及給藥 各組大鼠適應性飼養1 周后采用隨機數字表法隨機分為8 組，每組6 只。分別為:正常組(蒸餾水灌胃)、模型組(蒸餾水灌胃)、高劑量疏肝方組(9. 6 g·kg－1·d1柴胡疏肝散灌胃)、低劑量疏肝方組(3.2 g·kg－1·d－1柴胡疏肝散灌胃)、高劑量健脾方組(30.0 g·kg－1·d－1參苓白術散灌胃)、低劑量健脾方組(灌服10.0 g·kg－1·d－1參苓白術散)、高劑量綜合方組(39.6 g·kg－1·d－1柴胡疏肝散與參苓白術散合劑)和低劑量綜合方組(13.2 g·kg－1·d－1柴胡疏肝散與參苓白術散合劑)。各方藥組成和劑量均參考上海科學技術出版社《方劑學》［10］。低劑量組藥物為臨床常規用量，高劑量組藥物為臨床常規用量的3 倍用量。上述藥物均為中藥配方顆粒劑，使用前蒸餾水調配，深圳華潤三九醫藥股份有限公司生產，購于暨南大學附屬第一醫院中藥房。

2.2 大鼠模型建立 NASH 大鼠模型的建立參照我們以往的實驗方法［7-9］，并加以改進。除正常組大鼠給予基礎飼料喂養外，其余各組均以高脂飼料喂養。在施以造模因素的同時，各組按10 mL·kg－1給予相應的藥物或蒸餾水灌胃，各藥物組大鼠相應的藥物劑量按大鼠體表面積折算，每天早晚各1 次。各組動物自由飲水進食，分籠飼養于暨南大學醫學院病理生理學實驗室內［(24 ±2)℃，明暗各12 h］，每周定時稱重，根據體重調整藥量，連續16 周。

2.3 標本采集與樣本制備 各組動物均于末次給藥后，禁食不禁水12 h，3% 戊巴比妥鈉腹腔麻醉(1mL/kg)，剖腹，游離門靜脈主干并插管固定，迅速注入肝素鈉2 mL 1.5 ×106U/L)。采用離體循環灌注Ⅳ型膠原酶，差速離心、密度梯度離心和選擇性貼壁分離Kupffer 細胞，Typan blue 染色和流式細胞術(flow cytometry，FCM)進行細胞活性和純度鑒定。

2.3.1 Kupffer 細胞分離與純化 細胞上清液經800 ×g 4 ℃離心10 min，沉淀加RPMI-1640 培養基垂懸。取15 mL 離心管若干支，最下層鋪24%Nycodenz 2.5 mL，傾斜離心管45°用滴管沿管壁緩緩滴加11%Nycodenz 2.5 mL，用同樣方法最上層加入2.5 mL 細胞懸液，1 500 × g 4 ℃離心15 min(正常組Kupffer 細胞分離采取10.8% Nycodenz－17.2% Nycodenz 密度梯度)。離心完畢，可看到4 個分層:最上層是含有細胞碎片的培養基;最上層和11% Nycodenz 之間呈云霧狀細胞層為內皮細胞層;24% Nycodenz 和11% Nycodenz 之間云霧狀細胞層為Kupffer細胞層;管底沉淀為部分肝細胞、紅細胞及細胞碎片。吸管逐層吸棄前兩層，收集Kupffer 細胞層于15 mL 離心管中加Gey's 平衡鹽溶液垂懸，800 ×g 4 ℃離心5 min 2 次洗滌，沉淀用10%胎牛血清培養基垂懸，取懸液9∶1 Typan blue 進行染色，調整細胞濃度為(2 ～5)×109/L，接種于培養瓶，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。Kupffer 細胞貼壁能力很強，分離后15 min 開始貼壁，3 h 后幾乎完全貼壁，洗去未貼壁的細胞，更換新培養基，此即為純化的Kupffer細胞。

2.3.2 Kupffer 細胞FCM 鑒定 細胞用胰蛋白酶消化后，PBS 洗滌2 次，加入固定劑固定15 min，離心去上清后加入破膜試劑，加入Ⅰ抗Anti-Lysozyme 室溫孵育30 min，加入Ⅱ抗(羊抗兔IgG-FITC)室溫孵育30 min，用破膜試劑洗滌2 次后上機檢測。

2.3.3 Kupffer 細胞IKKβ 和NF-κB p65 mRNA 測定

Trizol 提取Kupffer 細胞RNA，測定含量并計算濃度，采用Oligo(dT)逆轉錄法，將RNA 逆轉錄為cDNA。從 GenBank 中 查 找 大 鼠 NF-κB (XM _342346.4)、IKKβ (NM_053355.2)和內參照GAPDH(NM_017008.3)的cDNA 序列，引物由上海捷瑞生物工程有限公司設計并合成。IKKβ 上游引物5’-CCGTGACTGTTGACTACTG-3’，下游引物5’-GTCCACTTCGCTCTTCTG-3’;NF-κB 上 游引 物5’-TGCATTCTGACCTTGCCTAT-3’，下 游 引 物 5 ’-TCCAGTCTCCGAGTGAAGC-3’;GAPDH 上游引物5’-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3’，下游引物5’-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3’。反應體系:2.5 ×Real Master Mix/20 ×SYBR solution 9 μL，上、下游引物各2 μL，DNA 模板1 μL，加滅菌雙蒸水補至總體積20 μL。反應條件:95 ℃預變性1 min，95 ℃10 s，GAPDH 57.5 ℃、IKKβ 52 ℃、NF-κB 60 ℃退火20 s，68 ℃延伸30 s，擴增40 個循環，反應完成后再于72℃至95 ℃，持續5 ～10 s 繪制熔解曲線。反應完畢，采用Opticon Monitor 3. 1 軟件分析結果，用公式2－ΔΔCt方法進行相對定量。Ct 值=每個反應管內的熒光信號到達所設定的閾值時所經歷的循環數，ΔΔCt = (Ct目的基因－Ct內參照基因)實驗組－(Ct目的基因－Ct內參照基因)正常組，以未處理的空白組基因表達水平為1，2－ΔΔCt=實驗組目的基因的表達相對于正常組的變化倍數。

2.3.4 Western blotting 分析Kupffer 細胞中IKKβ 和NF-κB p65 蛋白的表達 計數新鮮分離的細胞，每(5 ～10)×106加入1 mL RIPA 裂解液，對于核蛋白提取(檢測NF-κB 表達水平)參照碧云天細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒(No. P0027)，全程冰上操作。勻漿，裂解30 min 后，將裂解液移至1.5 mL EP 管中，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，取上清置于－80 ℃保存。配制BSA 標準液，混勻后室溫放置2 min，在分光光度計上比色分析，檢測樣品蛋白含量。配置凝膠，上樣，電泳進行蛋白質的電轉移與膜的封閉，將濾紙和濾膜在轉移緩沖液中浸泡15 min，將濾膜放在平皿中，用1 × 麗春紅溶液于脫色搖床上輕搖，染膜5 min 左右，然后用雙蒸水洗，將濾膜放在平皿中，封閉液室溫震搖1 ～2 h，4 ℃過夜，封閉結束后，將膜放入一塑料帶中，加入溶有Ⅰ抗的新鮮配制的封閉液;4 ℃輕輕振搖2 h，用封閉液清洗3 次，每次約10 ～15 min，以除去過量的Ⅰ抗;將膜轉入另一塑料袋中，加入溶于封閉液的Ⅱ抗;封口后室溫振搖孵育1 ～2 h;取出濾膜，用TBST 漂洗3 ～5 次，每次10 ～15 min，洗去未結合的Ⅱ抗，曝光、顯影、定影，凝膠圖像分析。

3 統計學處理

數據采用SPSS 13.0 統計軟件進行分析，數據以均數±標準差(mean±SD)或中位數(最小值～最大值)表示，組間均數比較采用單因素方差分析(Oneway ANOVA)，中位數比較采用Kruskal-Wallis 檢驗，以P ＜0. 05 表示差異有統計學意義。

結 果

1 Kupffer 細胞計數、活性和形態

每只NASH 大鼠純化后獲得Kupffer 細胞數量為(1.5 ～2.0)×107個。取少量用胰蛋白酶消化后行Typan blue 染色，血細胞計數板在倒置相差顯微鏡下細胞計數，測定其活力均在95%以上。新鮮分離的Kupffer 細胞呈圓形，體積較小，約15 min 后開始貼壁，3 h 后貼壁完全，部分細胞已伸出偽足，見圖1。

Figure 1. Isolated rat Kupffer cells culfured for 3 h (×100).圖1 純化后的Kupffer 細胞

2 FCM 鑒定Kupffer 細胞

如圖2 所示，M1 為低濃度標記峰標志，FITC 為異硫氰酸熒光素。以M1 起始點與橫坐標做平行線，平行線左側表示陰性細胞，右側表示陽性細胞，左圖應用兔IgG 作為陰性對照，未見陽性細胞，右圖可見陽性細胞。Anti-Lysozyme 檢測Kupffer 細胞:共檢測細胞10 000 個，表達lysozyme 的細胞共9 018 個，占所有細胞比例為90.18%，即Kupffer 細胞純度為90.18%。

Figure 2. The purity of Kupffer cells identified by flow cytometer. Isolated kupffer cells positive for lysozyme were more than 90.18%.圖2 FCM 細胞鑒定結果

3 各組大鼠Kupffer 細胞IKKβ 和NF-κB p65 mRNA 表達

與正常組比較，模型組Kupffer 細胞IKKβ 和NF-κB p65 mRNA 明顯升高(P ＜0.01);與模型組比較，IKKβ mRNA 以高劑量綜合方組、健脾方組和疏肝方組降低有統計學意義(P ＜0.01 或P ＜0.05)。NF-κB p65 mRNA 以高低劑量綜合方組、高劑量健脾方組和高劑量疏肝方組降低有顯著差異(P ＜0.01或P ＜0.05)，其中高劑量綜合方組和高劑量健脾方組降低趨勢最明顯，見表1、2。這提示NASH 的發生可能與Kupffer 細胞IKKβ 和NF-κB p65 mRNA 的高表達有關，而疏肝健脾方藥能不同程度降低其表達水平。

表1 Kupffer 細胞中IKKβ mRNA 的相對表達水平Table 1. The expression of IKKβ mRNA in Kupffer cells in each group［median(minimum ～maximum).n=6)］

表2 Kupffer 細胞NF-κB p65 mRNA 相對表達水平Table 2. The expression of NF-κB p65 mRNA in Kupffer cells in each group［median(minimum ～maximum).n=6)］

4 各組大鼠Kupffer 細胞IKKβ、p-IKKβ 和NF-κB p65 蛋白表達

與正常組比較，模型組Kupffer 細胞IKKβ、p-IKKβ 和NF-κB p65 蛋 白 表 達 均 顯著 升 高(P ＜0.01);與模型組相比，各藥物組IKKβ 蛋白表達都有不同程度降低(P ＜0.01 或P ＜0.05)，組間比較高劑量健脾方組優于其它各組(P ＜0.01)，IKKβ 和p-IKKβ 表達由低到高依次為高劑量健脾方組﹤高劑量綜合方組﹤低劑量綜合方組﹤高劑量疏肝方組﹤低劑量疏肝方組﹤低劑量健脾方組。各用藥組NFκB p65 蛋白表達也明顯降低(P ＜0.01)，高劑量健脾方組較其它各組降低更明顯(P ＜0.01 或P ＜0.05)，見圖3 和表3。上述結果表明，NASH 模型Kupffer 細胞可能存在著IKKβ/NF-κB 信號通路蛋白的高表達及活化，而疏肝健脾方藥在一定程度上能降低上述蛋白表達水平及活化，以高劑量健脾效果最明顯高劑量。

Figure 3. Expression of IKKβ，p-IKKβ and NF-κB p65 proteins in Kupffer cells. 1:normal group;2:model group;3:Shu-gan(high dose)group;4:Shu-gan (low dose)group;5:Jian-pi (high dose)group;6:Jianpi (low dose)group;7:composite (high dose)group;8:composite (low dose)group.圖3 各組大鼠Kupffer 細胞IKKβ、p-IKKβ 和NF-κB p65蛋白的表達

表3 Kupffer 細胞NF-κB 信號通路蛋白表達比較灰度值比較Table 3. Expression of IKKβ，p-IKKβ and NF-κB proteins in Kupffer cells in each group (mean±SD. n=6)

討 論

NF-κB 是一類重要的轉錄調控因子，在機體應激反應和免疫細胞活化、增殖、分化、凋亡及腫瘤的形成中發揮重要作用。能激活IκB 的一類蛋白被稱為IKK 復合物，是NF-κB 信號通路上游的調節蛋白，幾乎所有與NF-κB 激活有關的信號分子都要通過IKK 復合物介導產生效應［11］。研究表明，IKKα 和IKKβ 在NF-κB 信號通路的激活中發揮重要作用，尤其是IKKβ 在NF-κB 經典信號通路活化中發揮尤為重要的作用［12］。

NF-κB 通過2 種途徑參與NASH 的發病。(1)TIR (Toll/interleukin-1 receptor，TIR)家族。蛋白被配體激活后，通過活化MyD88-TRAF6-TAK1，從而啟動IKK-NF-κB 信號通路。(2)腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)家族。TNFR被配體激活后，發生三聚體化，與TNFR 相關死亡結構域蛋白(TRADD)形成TNFR-TRADD 復合物，募集TNFR 相關因子2(TRAF2)和受體相關蛋白(RIP)，TRAF 使RIP 泛素化，通過與IKK 的IKKγ 亞基結合使IKK 集聚于TNFR 復合物，從而活化IKK-NF-κB信號通路［13-14］。

本研究結果顯示，與正常組比較，NASH 模型組Kupffer 細胞IKKβ、NF-κB mRNA 及IKKβ、p-IKKβ、NF-κB 蛋白明顯升高，表明NASH 發病中可能存在著Kupffer 細胞IKKβ-NF-κB 信號通路的活化。與模型組比較，各用藥組Kupffer 細胞IKKβ mRNA 表達以高劑量綜合方組和高劑量健脾方組、高劑量疏肝方組降低有統計學意義，NF-κB mRNA 表達以高低劑量綜合方組、高劑量健脾方組和高劑量疏肝方組降低明顯，IKKβ 及NF-κB mRNA 以高劑量綜合方組和高劑量健脾方組下降趨勢更明顯。與模型組比較，各用藥組IKKβ 及磷酸化蛋白表達都有不同程度下調，高劑量健脾方組IKKβ 蛋白表達水平下降更為明顯，表達趨勢和IKKβ mRNA 基本相同。各用藥組NF-κB 表達也明顯降低，高劑量健脾方組較其它各組降低更明顯。這提示高劑量健脾方組和高劑量綜合方組藥物在IKKβ 和NF-κB mRNA 及蛋白表達方面都有明顯的下調作用。隨著NASH 炎癥程度的不斷加深，Kupffer 細胞中可能存在著NF-κB 信號通路的激活，NASH 的發生可能是啟動NF-κB 信號通路作用的結果，高劑量健脾方和高劑量綜合方藥物能起到很好的下調NF-κB 信號通路相關基因及蛋白表達的作用，可能是其防治NASH 的重要機制之一。

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