VEGF-siRNA誘導 MCF-7細胞凋亡及其機制

,,

(濱州醫學院生物化學教研室，山東 煙臺 264003)

血管內皮生長因子(VEGF)是目前發現的最重要的腫瘤血管生成促進因子。VEGF可通過旁分泌機制刺激腫瘤細胞血管生成，進而加速腫瘤細胞的增殖。新的研究結果也顯示，除了旁分泌作用機制外，VEGF還可通過自分泌機制抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤的發生發展。survivin是目前發現的最強的抗凋亡因子，它通過抑制細胞凋亡和促進細胞進入增殖期兩方面的作用對抗細胞凋亡。近幾年來，關于VEGF 與survivin相關性的研究逐漸展開。但是，應用RNA干擾(RNAi)技術沉默乳癌細胞VEGF表達后survivin基因是否相應下調,國內外尚未見報道。本文研究在前期實驗的基礎上，應用RNAi技術下調人乳癌MCF-7細胞VEGF表達后,采用流式細胞儀檢測細胞凋亡，分別從基因和蛋白水平檢測survivin在轉染前后的變化，以探討靶向VEGF的siRNA下調VEGF表達后引起的細胞凋亡狀態的改變，以及細胞凋亡與凋亡相關基因survivin的關系，從分子水平探討下調VEGF后誘導細胞凋亡的機制，為腫瘤的分子治療尋求新方向。現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人乳癌MCF-7細胞株，由青島大學醫學院生物化學與分子生物學實驗室凍存。DMEM培養基購自美國Gibco公司，標準胎牛血清購自民海生物科技有限公司。AMV逆轉錄試劑盒購自Promega公司；PCR檢測試劑盒購自TaKaRa公司，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自貝博公司；免疫組化檢測試劑盒SP-9001及DAB顯色試劑盒購自北京中杉試劑公司；兔抗人survivin單克隆抗體為Thermo公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 MCF-7細胞在含體積分數0.10胎牛血清、青霉素100 kU/L、鏈霉素100 mg/L的DMEM培養基中貼壁生長后，置37 ℃、體積分數0.05 CO2飽和濕度環境下培養。

1.2.2siRNA設計與合成 根據文獻[3]設計引物，VEGF siRNA序列：正義鏈5′-GGAGUACC-CUGAUGAGAUCUU-3′，反義鏈5′-GAUCUCAU-CAGGGUACUCCUU-3′；陰性對照siRNASCR(sc-ramble siRNA)序列：正義鏈5′-UUCUCCGAACG-UGUCACGUTT-3′，反義鏈5′-ACGUGACACGUU-CGGAGAATT-3′。兩序列均行BLAST比對分析以排除其同源性，并對VEGF siRNA正義鏈末端行甲基化修飾，以增強其穩定性。所用引物均由大連寶生物公司合成，所有序列均由上海吉瑪生物技術有限公司化學合成。

1.2.3siRNA轉染細胞及分組 選取生長狀態良好、貼壁生長至70%～80%融合的細胞種板。按每孔1.5×105個細胞數接種于6孔培養板，體積分數0.05 CO2、37 ℃條件下培養。轉染前1 d改用不含抗生素、僅含血清的培養基進行培養，細胞融合度達30%～50%時進行轉染。轉染時，棄去細胞孔板中舊培養液,按LipofectamineTM2000使用說明方法進行操作，首先用不含抗生素和血清的DMEM培養基將siRNA (50 pmol)和LipofectamineTM2000 (2.5 μL)分別稀釋至250 μL(siRNA的終濃度為100 nmol/L)，室溫孵育5 min后將兩者緩慢混勻，再經室溫孵育20 min后加到細胞板孔中，細胞置于含體積分數0.05 CO2、37 ℃飽和濕度的培養箱中培養，4 h后加入常規含血清培養基正常培養。實驗分為6組。空白對照組：實驗時棄正常培養基，只加無血清無抗生素的培養基;脂質體對照組：不加siRNA，只加入空脂質體LipofectamineTM2000;3個濃度siRNA組：siRNA終濃度分別為50、100、200 nmol/L;陰性對照(siRNASCR)組：siRNASCR終濃度為100 nmol/L。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 轉染VEGF siRNA 24 h后，流式細胞術檢測細胞凋亡情況。常規消化收集細胞，D-Hanks液輕柔沖洗細胞兩次，然后以400 μL Binding Buffer懸浮細胞，密度大約為1×108/L，然后加入5 μL Annexin V-FITC，輕柔混勻，2～8 ℃避光孵育15 min，孵育結束后加入10 μL的PI，輕柔混勻，2～8 ℃避光孵育5 min，1 h內應用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5半定量RT-PCR檢測survivin基因mRNA表達水平 轉染VEGF siRNA 24 h后，按照Trizol試劑盒操作說明提取細胞總RNA。將所提取總RNA 1 μg行20 μL體系逆轉錄反應，具體步驟按照逆轉錄試劑盒操作說明的方法進行。取cDNA行后續25 μL體系PCR反應，以β-actin為內參，其中survivin引物序列分別為：上游引物5′-GAGCTG-CAGGTTCCTTATC-3′,下游引物5′-ACAGCATC-GAGCCAAGTCAT-3′,擴增產物為434 bp；β-actin的引物序列為：上游引物5′-GTGACAGCAGTCGG-TTGG-3′,下游引物5′-AAAACTTACTACTCGG-AAGG-3′，產物長度298 bp。survivin PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環30次；72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后觀察拍照，然后應用天能分析軟件對各條帶進行吸光度(A)掃描，以各組survivin mRNA RT-PCR產物與其對應內參β-acting的A值之比表示survivin基因mRNA表達水平。

1.2.6免疫組化檢測MCF-7細胞survivin蛋白的表達 取對數生長期細胞，接種于鋪好蓋玻片的24孔板，正常培養24 h后棄去培養液，按照1.2.3所述方法進行VEGF siRNA轉染，48 h后棄去培養液，PBS沖洗3次，每次5 min，然后加40 g/L的多聚甲醛固定(4 ℃,30 min)，固定結束后吸干多聚甲醛，PBS沖洗3次，每次5 min。然后進行免疫組織化學染色,按照試劑盒的說明書操作。DAB顯色，操作嚴格按照DAB試劑盒說明書進行，顯微鏡下觀察顯色情況，控制顯色時間。顯色結束，自來水沖洗終止反應,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,實驗重復3次以上。survivin陽性染色呈棕黃色顆粒狀，定位于細胞質和細胞核。在每張玻片上隨機抽取3個視野，應用VIDAS圖像分析系統進行吸光度分析。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組細胞凋亡情況比較

轉染24 h以后，與空白對照組相比較，3個濃度siRNA組MCF-7細胞早、晚期凋亡率均增加，差異有顯著意義(F=35.81、30.12，q=6.08～56.53，P<0.05)；siRNASCR組、脂質體對照組早、晚期凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組survivin mRNA表達比較

轉染VEGF siRNA后24 h，3個濃度siRNA組survivin mRNA表達均下調，差異有顯著性(F=21.59，q=11.56～253.20，P<0.05、0.01)；其中50 nmol/L siRNA組survivin mRNA表達高于100 nmol/L siRNA組和200 nmol/L siRNA組，差異有統計學意義(q=8.75～35.40，P<0.05)；100 nmol/L siRNA組和200 nmol/L siRNA組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。siRNASCR組、脂質體對照組與空白對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、表2。

2.3 各組survivin蛋白表達水平比較

與空白對照組比較，3個劑量siRNA組survivin蛋白表達水平均降低(F=35.64,q=25.72～273.20,P<0.05、0.01)；其中50 nmol/L siRNA組survivin 蛋白表達明顯高于100、200 nmol/L siRNA組(q=69.80～358.70，P<0.01)，100 nmol/L siRNA組和200 nmol/L siRNA組之間差異無顯著性(P>0.05)；siRNASCR組、脂質體對照組與空白對照組之間比較差異無顯著意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組細胞凋亡情況比較

①Marker；②無酶水；③50 nmol/L VEGF siRNA組；④100 nmol/L VEGF siRNA組；⑤200 nmol/L VEGF siRNA組；⑥siRNASCR組；⑦脂質體對照組；⑧空白對照組。

表2 各組survivin mRNA和蛋白表達比較

3 討 論

VEGF是目前研究最多的血管生成促進因子，在正常成熟組織中較少表達，但在腫瘤組織中高度表達。已有文獻報道，VEGF在諸如乳癌、膀胱癌及血液系腫瘤如白血病、淋巴瘤和多發性骨髓瘤等多種惡性腫瘤組織中均呈現高表達[1-3]。VEGF和位于腫瘤血管內皮細胞上的特異性酪氨酸蛋白激酶受體(VEGFR)結合后，能夠促進血管內皮細胞增殖和分化，增強血管通透性，加速腫瘤新生血管的形成。FERRER等[4]研究顯示，在前列腺癌細胞中，除了高表達VEGF外，VEGF的受體 FLT-1 和FLK-1 都有表達。MEISTER等[5]研究顯示，人類神經母細胞瘤細胞株和神經母細胞瘤原位癌均有VEGF和受體FLK-1表達。其結果提示腫瘤細胞自身分泌的VEGF可以作用于細胞本身上的受體，通過一定的機制來對抗腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤的發生發展。其機制可能是：VEGF與腫瘤細胞上的受體結合后,激活了某種信號途徑，使一些原癌基因激活、抑癌基因失活,進而實現抗凋亡作用。

本文研究結果顯示，靶向VEGF的siRNA轉染入MCF-7細胞后能夠引起細胞凋亡率的增加，并且有一定的劑量依賴性。本實驗室前期研究結果已經證實，靶向VEGF的siRNA轉染入細胞后首先沉默VEGF的表達[6]，故可認為是VEGF表達的下調引起細胞凋亡率的增加，證實人乳癌MCF-7細胞中存在VEGF調控腫瘤細胞凋亡的自分泌機制。

為了進一步探討VEGF下調引起MCF-7細胞凋亡的分子機制，本實驗采用RT-PCR和細胞免疫組化技術，分別檢測了VEGF siRNA轉染MCF-7細胞以后，細胞凋亡相關基因survivin mRNA和蛋白表達水平的變化，以期在分子水平上尋找靶向VEGF的siRNA下調VEGF后引起MCF-7細胞凋亡的原因。 survivin又名生存素或存活素，是目前發現的最強的抗凋亡因子，正常情況下，發育成熟的組織(胸腺和生殖腺除外)中不表達survivin，僅在胚胎組織中有survivin的表達[7]。但是在包括乳癌在內的多種惡性腫瘤組織中都檢測到survivin異常高表達。TANAKA等[8]研究結果顯示，乳癌組織中survivin陽性表達率高達70.7%，但癌旁組織中陰性表達，提示survivin可能參與了乳癌的發生發展。survivin對抗細胞凋亡的主要機制是：①survivin是凋亡效應性蛋白酶caspase3和caspase7的直接抑制劑; ②survivin與細胞周期調節蛋白CDK4形成 survivin/CDK4復合物，阻斷細胞凋亡信號傳導通路[9];③survivin與紡錘體纖維結合，間接抑制凋亡酶caspase對紡錘體的水解作用。

已有研究結果顯示，血管內皮細胞中VEGF對survivin的表達具有正向調控作用，即二者之間存在著正相關關系，VEGF能夠對survivin的表達產生增強和誘導作用，而survivin的表達上調則是內皮細胞在血管生成過程中維持生存活力的必要條件[10]。ZHOU 等[11]研究顯示，人卵巢癌中下調VEGF的表達可使癌細胞中survivin的表達下調。但是應用RNAi的方法下調VEGF后能否引起survivin表達相應下調尚未見報道。本研究結果顯示，各濃度siRNA轉染組survivin mRNA及蛋白表達水平均較空白對照組降低，證實應用RNAi下調VEGF后survivin的表達隨之下調，并且達到一定干擾濃度之后會顯著下調(100 nmol/L siRNA組)。推測在VEGF的信號傳導通路中，survivin可能是其下游分子，沉默VEGF所致的細胞凋亡在一定程度上是通過下調survivin表達來實現。

綜上所述，人乳癌MCF-7細胞存在VEGF及其受體的自分泌環路。靶向VEGF基因的siRNA轉染MCF-7 后可誘導細胞凋亡，其分子機制與凋亡相關基因survivin表達有關。因此，以VEGF為靶點，應用 RNAi治療乳癌具有雙重效應，一方面通過抑制VEGF的自分泌途徑，以達到誘導腫瘤細胞凋亡的目的；另一方面通過抑制VEGF的旁分泌途徑，降低了腫瘤血管內皮細胞的增殖分化，通過減少腫瘤組織新生血管的生成來對抗腫瘤的發展。為腫瘤基因治療提供了新的依據。

[1] TOI M, HOSHINA S, TAKAYANAGI T, et al. Association of vascular endothelial growth factor expression with tumor angiogenesis and with early relapse in primary breast cancer[J]. Japanese Journal of Cancer Research: Gann, 1994,85(10):1045-1049.

[2] CHOW N H, LIU H S, CHAN S H, et al. Expression of vascular endothelial growth factor in primary superficial bladder cancer[J]. Anticancer Research, 1999,19(5C):4593-4597.

[3] BELLAMY W T, RICHTER L, FRUTIGER Y, et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in hematopoietic malignancies[J]. Cancer Research, 1999,59(3):728-733.

[4] FERRER F, MILLER L J, LINDQUIST R, et al. Expression of vascular endothelial growth factor receptors in human prostate cancer[J]. Urology, 1999,54(3):567-572.

[5] MEISTER B, GRüNEBACH F, BAUTZ F, et al. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors in human neuroblastoma[J]. European Journal of Cancer, 1999,35(3):445-449.

[6] 張曉,徐文華,葛銀林,等. VEGF基因特異性siRNA轉染后對人乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2007,23(1):14-17.

[7] 李美玲,高美華,宋云峰,等. Survivin和Caspase-3在乳癌組織的表達及相關性[J]. 齊魯醫學雜志, 2009,24(5):378-379.

[8] TANAKA K, IWAMOTO S, GON G, et al. Expression of survivin and its relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas[J]. Clinical Cancer Research: an Official Journal of the American Association for Cancer Research, 2000,6(1):127-134.

[9] 孫志清,項鋒鋼,王文華. 人腦星形細胞瘤組織Survivin與VEGF表達及意義[J]. 齊魯醫學雜志, 2008,23(6):486-488,491.

[10] MESRI M, MORALES-RUIZ M, ACKERMANN E J, et al. Suppression of vascular endothelial growth factor-mediated endothelial cell protection by survivin targeting[J]. The American Journal of Pathology, 2001,158(5): 1757-1765.

[11] ZHOU J S, GAN N Y, ZHANG W J, et al. Proliferation suppression and apoptosis of ovarian carcinoma cells induced by small interfering RNA against vascular endothelial growth factor[J]. The Journal of Obstetrics and Gynaecology Research, 2010,36(2): 232-238.