Notch1蛋白在淋巴瘤組織的表達及意義

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(青島大學醫學院,山東 青島 266003 1 附屬醫院血液科; 2 血液學教研室; 3 附屬醫院中心實驗室)

淋巴瘤是一種異質性疾病，根據組織形態學特征，分為霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，是發病率較高的惡性血液系統腫瘤[1]。隨著分子生物學、基因組學的研究進展,部分淋巴瘤的發病機制已明確，靶向治療的研究及臨床新藥的應用使其具有治愈的可能。但仍有部分淋巴瘤易復發，難以治愈。研究顯示，信號通路可能參與淋巴瘤的發生。Notch信號通路是一種廣泛且高度保守的信號通路，該通路參與細胞的增殖、分化和凋亡[2-3]，在造血細胞的增殖和分化中起重要作用，其異常時可導致血液系統惡性腫瘤[4]。本研究檢測淋巴瘤Notch1蛋白的表達情況，探討其在淋巴瘤發生中的作用。

1 資料與方法

1.1 標本及其來源

收集2009年10月—2011年11月我院附屬醫院病理科確診的淋巴瘤標本50例，其病歷資料完整。男30例，女20例；年齡6～80歲。診斷符合《血液病診斷及療效標準》[5]。其中T細胞淋巴瘤30例，B細胞淋巴瘤13例，霍奇金淋巴瘤7例。所有病人病理活檢前均未進行抗腫瘤化療或放療。另取15例淋巴結反應增生組織標本作為對照組。所有組織標本應用40 g/L甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續切片。

1.2 主要試劑

兔抗人跨膜受體蛋白Notch1抗體、SP免疫組化檢測試劑盒、DAB染色試劑盒，均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 Notch1蛋白表達檢測

采用免疫組織化學SP染色法。石蠟切片60 ℃烘片，常規二甲苯脫蠟、乙醇水化，枸櫞酸緩沖液高溫抗原修復15 min，體積分數0.03的H2O2室溫避光孵育20 min，阻斷內源性過氧化物酶。正常山羊血清封閉抗原，滴加一抗(稀釋度1∶100)，4 ℃過夜,滴加二抗、三抗。DAB顯色，蘇木精復染，藍化、分化，脫水、透明，干燥后中性樹膠封片。用已知子宮內膜癌陽性標本作陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判定

根據文獻[6]方法進行染色程度和染色強度判定。高倍鏡下觀察，腫瘤細胞染色程度：無細胞染色為陰性，染色細胞占1%～33%為1分，34%～66%為2分，67%～100%為3分。染色強度：不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，深褐色為3分。綜合上述兩項評分之和判定結果：≤1分為陰性(-)，2分以上為陽性(+)。

1.5 統計學分析

用SPSS 17.0及PPMS 1.5[7]統計軟件進行數據處理，數據間比較采用四格表卡方檢驗或Fisher確切概率法。

2 結 果

2.1 淋巴瘤組和對照組Notch1蛋白表達比較

Notch1蛋白免疫組化陽性染色主要集中在淋巴瘤細胞膜和(或)胞漿，部分淋巴瘤細胞核亦染色，陽性細胞呈散在分布；對照組有1例細胞漿著色。Notch1蛋白在淋巴瘤組和對照組中的陽性率分別為58.00%(29/50)、6.67%(1/15)，兩者比較差異有統計學意義(χ2=12.234,P<0.01)。

2.2 不同類型淋巴瘤組織Notch1蛋白表達水平比較

Notch1蛋白在T細胞淋巴瘤組、霍奇金淋巴瘤組及B細胞淋巴瘤組中的陽性率分別為70.00%(21/30)、71.40%(5/7)，23.80%(3/13)，T細胞淋巴瘤組和霍奇金淋巴瘤組Notch1蛋白表達明顯高于對照組，差異有顯著性(χ2=16.052，P<0.05；P=0.004)；而B細胞淋巴瘤組與對照組Notch1蛋白表達水平差異無顯著意義(P=0.311)。3種類型淋巴瘤Notch1蛋白表達相比較，T細胞淋巴瘤組高于B細胞淋巴瘤組，差異有統計學意義(χ2=8.097，P<0.05)；霍奇金淋巴瘤組與T細胞淋巴瘤組比較、霍奇金淋巴瘤組和B細胞淋巴瘤組比較，差異均無統計學意義(P=1.000、0.062)。

2.3 不同年齡、性別淋巴瘤病人Notch1蛋白表達比較

不同年齡、不同性別淋巴瘤病人Notch1蛋白陽性表達比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同年齡、性別淋巴瘤病人Notch1蛋白表達比較(例)

3 討 論

Notch蛋白是高度保守的跨膜蛋白，由Notch受體蛋白、Notch配體蛋白、轉錄因子CSL(DNA結合蛋白)和靶分子組成。正常情況下，Notch信號介入多種細胞凋亡、增殖和分化等多效性作用，調節多細胞動物的形態發育和形成[2]。Notch1最早在人類T淋巴母細胞白血病中被鑒定出來，提示Notch信號通路與腫瘤相關[8]。Notch1在多數惡性腫瘤中表達上調，但也有少數實驗顯示其表達下調[9]。其原因可能與細胞特異性有關。本文研究結果顯示，淋巴瘤組織中Notch1蛋白表達水平較對照組明顯增高。提示Notch1蛋白高表達可能與淋巴瘤的發生有關。

Notch1在淋巴細胞發育的早期階段促進共同淋系前體細胞向T淋巴細胞發育，共同淋巴細胞祖細胞分化成T淋巴細胞祖細胞后，Notch1信號能促進T淋巴細胞向Tαβ細胞發育，抑制其向Tγδ細胞發育；同時還促進CD4+、CD8+雙陽性胸腺細胞向CD4+或CD8+單陽性細胞分化[10]。Notch1信號通路能加快細胞周期，使細胞處于增殖狀態，抑制細胞分化和凋亡[11]。Notch1信號在T細胞發育過程中任意環節的紊亂都可能與細胞惡性轉化相關。本文研究結果顯示，T細胞淋巴瘤組中Notch1蛋白的表達明顯高于對照組，與JUNDT等[12]研究結果相似。國外有研究顯示，大多數腸型T細胞淋巴瘤存在Notch1基因的點突變[13]；也有研究證實，超過50%的T淋巴母細胞淋巴瘤在Notch1的HD和PEST區域存在突變[14]。表明T細胞淋巴瘤的發生可能與Notch1蛋白的表達升高有關，Notch1蛋白的高表達可能與其基因突變有關。

本文的研究結果還顯示，霍奇金淋巴瘤組織中Notch1蛋白80%高表達，提示 Notch1可能在霍奇金淋巴瘤中發揮一定的作用。這與JUNDT等[12]的研究結果類似，表明霍奇金淋巴瘤的發生與Notch1的表達升高有關。Notch信號通路可通過促進細胞生長和抑制細胞凋亡誘導霍奇金淋巴瘤的發生。

Notch受體在B細胞淋巴瘤中的作用存在分歧。TOHDA等[15]研究結果表明，彌漫大B細胞淋巴瘤細胞株(TMD8)存在靶基因Hes-1的表達，表明Notch信號被活化，提示在某些B細胞淋巴瘤中，Notch活化是致癌基因。另有研究結果顯示，活化的 Notch1抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，起抑癌基因的作用[16]。本研究結果顯示，B細胞淋巴瘤組織中Notch1蛋白表達與對照組比較差異無顯著性，與上述文獻結果不一致，提示Notch1信號通路在淋巴瘤中的作用是多環節的，各個環節所起的作用不同。Notch信號在B細胞淋巴瘤發生中的作用還有待進一步研究。

綜上所述，Notch1的異常表達可能與淋巴瘤的形成有關，Notch1在不同類型淋巴瘤中的作用可能不同。本文結果為靶向抑制Notch1信號通路治療淋巴瘤提供了初步依據。Notch信號在淋巴瘤發生發展中的確切作用及其機制還有待進一步研究。

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