肺癌組織P-gp、GST-Ⅱ和TOPO-Ⅱ表達及與Ki-67相關性

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(青島大學醫學院附屬青島市市立醫院病理科，山東 青島 266071)

肺癌是全球死亡率最高的惡性腫瘤之一，大多數病人確診時已到中晚期，失去手術機會，化療是主要的治療手段[1]。多藥耐藥(MDR)是導致肺癌治療失敗的主要原因之一，嚴重影響了病人的化療效果和生存率。本文采用免疫組織化學方法檢測63例肺癌組織中P-糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽-S-轉移酶Ⅱ(GST-Ⅱ)及DNA拓撲異構酶(TOPO-Ⅱ)的表達，探討它們與細胞核增殖抗原(Ki-67)的相關性。

1 材料與方法

1.1 標本

收集我院病理科2011年1月—2012年3月因肺癌行手術切除標本63例，術前均未行放療及化療。男41例，女22例；年齡35～83歲，中位年齡58歲；腫瘤直徑≤3 cm 者30例，> 3 cm者 33例；組織學類型(WHO分類)：鱗癌21例，腺癌24例，小細胞肺癌12例，大細胞癌6例；無淋巴結轉移19例，癌轉移到附近或遠處淋巴結及其他組織器官44例；病理學分級：中、高分化30例，低分化33例；有吸煙史者36例，無吸煙史者27例。所有標本均經40 g/L甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，常規蘇木精-伊紅染色。

1.2 免疫組織化學檢測

采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(SP法)分別進行檢測，P-gp和GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ和Ki-67一抗及SP試劑盒均購自福州邁新生物技術開發公司。嚴格按照試劑盒說明書步驟進行操作，用已知陽性肝癌切片作陽性對照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作陰性對照。

1.3 結果判定

光學顯微鏡下以胞核、胞膜、胞漿中存在棕黃色顆粒為陽性，其中P-gp的陽性顆粒主要分布于胞質和(或)胞膜，GST-Ⅱ的陽性顆粒主要分布于胞核和(或)胞質，TOPO-Ⅱ和Ki-67的陽性顆粒分布于胞核。根據染色程度和染色陽性細胞百分數進行評分[2]。按染色程度:不著色計為0分，淡黃色計為1分，黃色計為2分，棕褐色計為3分。按染色陽性細胞所占百分比: 著色陽性細胞占計數細胞<5%計為0分，5%～25% 計為1分，26%～50%計為2分，>50%計為3分。將二者評分相乘，0～3分者為陰性，≥4分者為陽性。

1.4 統計學處理

采用卡方檢驗法分析P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ、Ki-67表達與其臨床病理特征之間的關系，應用Spearman等級相關分析P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ與Ki-67的相關性。

2 結 果

2.1 P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ和 Ki-67蛋白表達與肺癌臨床病理特征的關系

P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ和Ki-67在肺癌組織中的陽性表達率分別為61.9%、63.5%、77.8%和39.7%。P-gp、GST-Ⅱ在非小細胞癌組織的陽性表達率明顯高于小細胞癌(χ2=8.561、9.475,P<0.01)。中高分化癌組織中GST-Ⅱ的陽性表達率明顯高于低分化癌組織(χ2=6.733,P<0.01)。TOPO-Ⅱ在鱗癌和小細胞癌組織中的陽性表達率明顯高于腺癌(χ2=8.259、4.189,P<0.01、0.05)。Ki-67在小細胞癌組織中的陽性表達率明顯高于非小細胞癌(χ2=22.532,P<0.01)，在低分化癌組織的陽性表達率明顯高于中高分化組織(χ2=9.270,P<0.01)。P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ、Ki-67的陽性表達率與肺癌病人的年齡、性別、是否有吸煙史、腫瘤的大小以及有無淋巴結轉移等因素均無相關性(P>0.05)。見表1。

表1 P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ、Ki-67蛋白表達與肺癌臨床病理特征的關系(例(χ/%))

2.2 肺癌組織中P-gp、GST-Ⅱ和TOPO-Ⅱ的共表達

在63例肺癌組織中，P-gp和TOPO-Ⅱ的單獨表達率分別為3.2%(2/63)和19.0%(12/63)，沒有發現GST-Ⅱ的單獨表達。P-gp和GST-Ⅱ的共表達率為49.2%(31/63)；GST-Ⅱ和TOPO-Ⅱ的共表達率為9.5%(6/63)；P-gp和TOPO-Ⅱ的共表達率為6.3%(4/63)；P-gp、GST-Ⅱ及TOPO-Ⅱ的共表達率為25.4%(16/63)。有兩個或兩個以上MDR基因產物共表達率合計為90.5%，明顯高于單獨基因產物P-gp和TOPO-Ⅱ的表達率(χ2=59.660,P<0.01)。

2.3 肺癌組織中的P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ表達與Ki-67表達的相關性

Ki-67在肺癌組織中的陽性表達與P-gp、GST-Ⅱ的陽性表達之間無顯著相關性(P>0.05)，而與TOPO-Ⅱ的表達呈明顯正相關(r=0.380，P<0.01)。

3 討 論

MDR是導致肺癌化療失敗最難解決的問題之一[3]。MDR的產生是多基因、多途徑共同作用的結果，同時檢測多個MDR基因的表達，可為臨床提供更多的信息并指導臨床化療藥物的選擇。Ki-67作為一種核增殖抗原，是目前檢測腫瘤細胞增殖活性最可靠的指標之一[4]。

P-gp是相對分子質量為17萬的蛋白產物，生理功能相當于一個藥物排除泵，將進入癌細胞內的抗癌藥物泵出癌細胞，從而使癌細胞內藥物濃度降低，也可使藥物在細胞內再分布，出現耐藥現象[5-6]。因此，P-gp的表達水平與耐藥程度呈正相關。本文結果顯示，P-gp在非小細胞癌組織中陽性表達率明顯高于小細胞癌，腺癌高于磷癌(大細胞癌例數較少，未做統計)，此結果與臨床上小細胞癌化療最敏感、鱗癌次之、腺癌最差相符。說明P-gp的高表達是非小細胞肺癌產生耐藥性的主要原因。本文結果還顯示，P-gp的表達與病人年齡、性別、是否吸煙、腫瘤大小以及有無淋巴結轉移無關，與國外相關報道相符[7-8]。

GST-Ⅱ是一種藥物代謝酶，一方面可以催化親電物質與谷胱甘肽結合，另一方面與親脂性細胞毒藥物結合增加藥物水溶性，促進其代謝，從而降低抗癌藥物的細胞毒作用，GST-Ⅱ的陽性表達與腫瘤耐藥相關[9]。本文結果顯示，GST-Ⅱ的表達與肺癌病理學分型有關，GST-Ⅱ在非小細胞癌中的陽性表達率明顯高于小細胞癌，與臨床上小細胞肺癌首次化療敏感相符。由此可以認為，GST-Ⅱ的高表達是非小細胞癌產生耐藥性的原因之一。中高分化癌與低分化癌相比，前者GST-Ⅱ的陽性表達率明顯高于后者，說明分化較高的肺癌耐藥性較強[10]。本文結果還顯示，GST-Ⅱ的表達與病人年齡、性別、是否吸煙、腫瘤大小以及有無淋巴結轉移無關。

TOPO-Ⅱ是DNA復制和轉錄所需要的基本核酶，一方面作為細胞的增殖指數，另一方面作為抗癌藥物的靶點指數。化療藥物如VP16、替尼泊苷和阿霉素等通過與TOPO-Ⅱ結合造成DNA復制和轉錄異常，因此TOPO-Ⅱ是腫瘤治療的主要靶酶。本文的研究結果顯示，TOPO-Ⅱ在鱗癌和小細胞癌中的陽性表達率明顯高于腺癌，提示TOPO-Ⅱ的低水平表達使VP16等抑制劑喪失作用靶點，無法抑制TOPO-Ⅱ發揮作用，所以TOPO-Ⅱ可作為一種潛在的預示化療敏感性的標記物[11]。本文結果還顯示，TOPO-Ⅱ的表達與病人年齡、性別、是否吸煙、腫瘤大小以及有無淋巴結轉移無關。

有文獻報道，Ki-67陽性表達率與肺癌的侵襲力、惡性程度呈正相關[12]。本文結果顯示，Ki-67的表達與肺癌組織類型及分化程度有關，在小細胞癌組織表達明顯高于非小細胞癌，在低分化癌組織表達明顯高于中高分化癌，說明癌組織分化程度越低，Ki-67表達越高，Ki-67表達與肺癌的惡性程度呈正相關。本文結果還顯示，Ki-67的表達與P-gp、GST-Ⅱ的表達之間無顯著相關性，與TOPO-Ⅱ的表達呈明顯正相關。說明TOPO-Ⅱ可作為一種研究腫瘤細胞增殖活性的特異性指標[13]，同時檢測Ki-67和TOPO-Ⅱ可以更好地判斷瘤細胞的增殖狀態。

有研究表明，非小細胞肺癌存在多種耐藥基因共同表達的現象[14]。本文結果顯示，有兩個或兩個以上MDR基因產物的共表達率明顯高于單獨基因產物P-gp、GST-Ⅱ的表達率，提示肺癌耐藥的單基因作用較弱，其耐藥機制是多種基因共同作用的結果。P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ三者可能相互依賴，共同作用，具體機制有待于進一步研究。因此，同時檢測P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ可為臨床化療提供更多的耐藥信息，進而指導臨床對化療藥物的選擇。

綜上所述，P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ共同參與了肺癌的耐藥機制，三者相互依賴，共同作用；Ki-67與肺癌的惡性程度呈正相關。臨床上同時檢測上述4種基因，對于揭示肺癌耐藥的原因，估計化療效果，判斷預后，以及指導合理選擇化療藥物，制定有效的化療方案，延長肺癌病人的生存期意義很大。

[1] 王文蘋,季旭明,歐陽兵,等. 逆轉肺癌多藥耐藥的研究進展[J]. 世界中西醫結合雜志, 2011,6(9):820-822.

[2] OLAUSSEN K A, DUNANT A, FOURET P, et al. DNA repair by ERCC1 in non-small-cell lung cancer and cisplatin-based adjuvant chemotherapy[J]. N Engl J Med, 2006,355(10):983-991.

[3] 李國仁,戴建華,王燕青,等. 肺癌組織中耐藥相關基因的表達水平及其臨床意義[J]. 中國肺癌雜志, 2002,5(1):35-37.

[4] ZHENG J N, MAT X, CAOJ Y, et al. Knockdown of Ki-67 by small interfering RNA leads to inhibition of proliferation and induction of apoptosis in human renal carcinoma cells[J]. Life Science, 2006,78(7):724-729.

[5] ENDICOTT J A, LING V. The

biochemistry of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance[J]. Ann Rev Biochem, 1989,58:137-171.

[6] ARANCIA G, MOLINARI A, CALCABRINI A, et al. Intracellular P-glycoprotein in multidrug resistant tumor cells[J]. Ital J Anat Embryol, 2001,106:59-68.

[7] GALIMBERTI S, MARCHETTI A, BUTTITTA F, et al. Multidrug resistance related genes and p53 expression in human non small cell lung cancer[J]. Anticancer Research, 1998,18(40):2973-2977.

[8] BEER T W, ROWLANDS D C, CROCKER J, et al. Detection of the multidrug resistance marker P-glycoprotein by immunohistochemistry in malignant lung tumours[J]. Thorax, 1996,15:526-529.

[9] 曲延剛,紀祥瑞,唐愛萍. 多藥耐藥相關蛋白在乳腺浸潤性導管癌中的表達[J]. 青島大學醫學院學報, 2007,43(1):70-71.

[10] 聶坤榮,李春海,諸亞君,等. 肺癌谷胱甘肽轉移酶表達的免疫組化研究[J]. 中華結核和呼吸雜志, 1993,16(3):141-143.

[11] 李凡彩,周英瓊,侯巧燕,等. P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ在肺癌中的表達及意義[J]. 華夏醫學, 2005,18(1):1-5.

[12] 楊景偉,魏煜程,沈毅,等. Fas和Ki-67在非小細胞肺癌組織中的表達[J]. 齊魯醫學雜志, 2007,22(3):212-214.

[13] 孫冰生,吳煥明. 非小細胞肺癌拓撲異構酶Ⅱ的表達及其與Ki67、p53的關系[J]. 華中科技大學學報：醫學版, 2004,33(2):118-121.

[14] 劉欣燕,張書敏,邢秋月,等. 非小細胞肺癌P-gp、LRP、MRP和GST-Ⅱ表達及其臨床意義[J]. 現代腫瘤醫學, 2009,17(8):1444-1447.