胰腺癌組織HIF-1α、Endostatin和VEGF表達及意義

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(1 青島大學醫學院附屬醫院肝膽外科，山東 青島 266003； 2 成都市第二人民醫院肝膽外科)

腫瘤的快速生長需要消耗大量的營養物質，而在病理狀態下新生血管形成的速度跟不上腫瘤的生長速度，因此，無法提供足夠營養物質導致腫瘤組織呈現低氧狀態。低氧誘導因子-1α(HIF-1α)在低氧誘導的基因表達調節中起著重要作用，HIF-1α參與維持腫瘤細胞的能量代謝、新血管形成等。內皮抑素(Endostatin)可抑制內皮細胞生長，從而抑制新血管的生成，進一步抑制惡性腫瘤的生長及轉移。血管內皮生長因子(VEGF)能夠促進內皮細胞的分裂增殖和遷移，促進血管的形成。本研究應用免疫組化SABC法分別檢測HIF-1α、Endostatin、VEGF在胰腺癌組織中表達的變化，分析HIF-1α、Endostatin、VEGF與胰腺癌臨床病理特征關系及三者間的相關性，探討三者在胰腺癌發生、發展和轉移的作用。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集青島大學醫學院附屬醫院肝膽外科2008—2010年間手術切除的胰腺癌標本35例(臨床資料完整)，術后病理證實均為胰腺導管腺癌，且術前均未接受放化療及其他治療。病人男22例，女13例；年齡≤60歲17例，>60歲18例；腫瘤位于胰頭22例，胰體尾13例；高中分化19例，低分化16例；腫瘤直徑≤2 cm者11例，>2 cm者24例。根據國際抗癌聯盟(UICC，1997)制定的胰腺癌TNM分期標準，Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ～Ⅳ期11例；有淋巴結轉移10例，無淋巴結轉移25例。以取自肝移植術供體正常胰腺組織8例作為對照組。

1.2 HIF-1α、Endostatin和VEGF表達檢測

采用SABC免疫組織化學方法，參照SABC試劑盒說明書操作。兔抗人VEGF單克隆抗體、Endostatin抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，兔抗人HIF-1α單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，SABC試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。實驗采用已知胰腺癌陽性切片作為陽性對照，用PBS液代替一抗孵育已知胰腺癌陽性切片作為陰性對照。

1.3 結果判定

VEGF、Endostatin陽性表達為棕黃色顆粒，主要位于細胞質；HIF-1α陽性表達為棕黃色顆粒，主要表達于細胞核和細胞質。在雙盲條件下，由兩名病理科醫師對切片進行觀察，每個位點隨機選10個高倍視野(200倍)，結果判定采用半定量積分法分級。①染色強度：0分，無表達；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。②陽性細胞百分比：0分，無；1分，1%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，>75%。以染色強度和陽性細胞百分比兩項計分之和為總積分，總積分0分為(-)，2～3分為(±)，4～5分為(+)，6～7分為()，將(+)和()判定為陽性。

1.4 統計學處理

應用SPSS 13.0軟件進行統計學處理，計數資料比較應用χ2檢驗，相關性應用Spearman相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 胰腺癌組和對照組HIF-1α、Endostatin和VEGF表達的比較

胰腺癌組織HIF-1α主要表達于細胞核和細胞質，陽性率為71.43%(25/35)，對照組無HIF-1α陽性表達；Endostatin主要表達于細胞質，胰腺癌組織陽性率為77.14%(27/35)，對照組為37.50%(3/8)；胰腺癌組織VEGF表達主要位于細胞質，陽性率為68.57%(24/35)，對照組無陽性表達。胰腺癌組織HIF-1α、Endostatin、VEGF表達均顯著高于對照組，差異均有顯著性(χ2=2.415～13.651，P<0.05)。

2.2 胰腺癌組織HIF-1α、Endostatin、VEGF表達與臨床病理特征的關系

胰腺癌組織HIF-1α、Endostatin表達與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移有關(χ2=4.418～6.417，P<0.05)；VEGF表達與腫瘤大小、TNM分期及淋巴結轉移有關(χ2=6.417～8.670,P<0.05)。見表1。

表1 胰腺癌組織中HIF-1α、Endostatin和VEGF表達與臨床病理特征的關系(例)

2.3 胰腺癌組織中HIF-1α、Endostatin和VEGF表達的相關性

Spearman相關分析結果顯示，胰腺癌組織中VEGF、Endostatin的表達與HIF-1α表達呈正相關(r=0.662、0.409，P<0.01)；Endostatin表達與VEGF表達無相關性(r=0.218，P>0.05)。

3 討 論

胰腺癌起病隱匿，惡性程度高，進展速度快，目前缺乏有效的早期診斷方法，確診時往往已有轉移，手術切除率低、預后差。盡管胰腺癌的治療取得了巨大進展，但預后不良的情況卻沒有得到根本改觀。

HIF-1α是一種在哺乳動物組織中廣泛存在的轉錄因子，是低氧狀態下新生血管生成的重要調控因子。當細胞低氧時，HIF-1α在細胞核內高表達，參與新生血管生成的全過程[1-7]。腫瘤新生血管形成在腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移中起著重要作用，并影響著腫瘤的預后。腫瘤生長速度快，導致腫瘤組織低氧狀態，在低氧狀態下，組織HIF-1α表達增強，穩定性提高，HIF-1α通過多種途徑促進新生血管的形成，為腫瘤的生長提供營養物質。本研究結果表明，HIF-1α在正常組織不表達，在胰腺癌組織中高表達并且與腫瘤的TNM分期、淋巴結轉移有關。提示HIF-1α在胰腺癌組織中高表達促進腫瘤的增殖和轉移。

Endostatin可抑制內皮細胞生長，進而抑制新血管的生長。本文的研究結果顯示，胰腺癌組織中Endostatin表達高于對照組，差異有顯著意義；胰腺癌組織中Endostatin表達與TNM分期、淋巴結轉移有關。腫瘤的生長引起新生血管的生長，導致Endostatin在腫瘤組織中高表達。Endostatin具有抗腫瘤生物活性，抑制血管內皮細胞的分裂增殖，抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的生長。Endostatin抑制淋巴管的生成及淋巴管轉移，還可以抑制腫瘤細胞對血管的侵襲。

VEGF是一種糖蛋白，是1989年由FERRARA等利用硫酸銨析出、肝素瓊脂糖親和層析法及兩次反相高壓液相色譜純化方法，從牛垂體濾泡星狀細胞培養液中得到的。它是內皮細胞的特異性絲裂原，也是一種有效的血管形成和血管通透性誘導因子，也稱血管滲透因子。VEGF是參與新生血管形成的最有力的因子，促進腫瘤血管內皮細胞的分裂增殖，進而促進腫瘤新生血管的生成，參與腫瘤的發生發展過程。在腫瘤生長過程中，環境因素和基因變化誘發血管生成因子上調或血管生成抑制因子下調。血管生成因子與其受體結合，激活內皮細胞分裂增殖，并且促進其分泌多種酶，降解基膜，溶解新生血管芽的細胞外基質，促進新生血管的形成。惡性腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移都有賴于新生血管的形成。有研究顯示，VEGF在胰腺腫瘤組織中高表達，VEGF表達與MVD、腫瘤大小、局部擴散直接相關[8]。本文結果顯示，VEGF在胰腺癌組織中高表達，其表達與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移有關。提示VEGF在胰腺癌發生、發展、侵襲和轉移中發揮著重要作用。

本研究還顯示，人胰腺癌組織中VEGF、Endostatin表達與HIF-1α表達呈正相關。腫瘤生長速度快，需要消耗大量的營養物質，營養物質主要來自血液，血液需要血管來運輸，腫瘤新生血管形成在腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移中起著重要作用。隨著腫瘤的體積不斷增大，血供不能滿足其生長的需要，腫瘤呈現低氧狀態，HIF-1α在低氧狀態時表達增高，穩定性增強，增多的HIF-1α通過與其靶基因結合促進新生血管的形成，為腫瘤的生長提供營養物質。其中VEGF是HIF-1α最重要的靶基因。本文的結果顯示，HIF-1α、Endostatin、VEGF在胰腺癌組織中均有表達，且三者表達均顯著高于對照組；VEGF、Endostatin的表達與HIF-1α表達呈正相關。由此可推斷，HIF-1α表達增多誘導胰腺癌組織內低氧，低氧環境使VEGF表達增多，并導致拮抗因子Endostatin在腫瘤組織中高表達。Endostatin抑制血管內皮細胞的分裂增殖，抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的生長。本文結果還顯示，胰腺癌組織HIF-1α、Endostatin表達與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移有關；VEGF表達與腫瘤大小、TNM分期及淋巴結轉移有關。HIF-1α、Endostatin的檢測可能有助于胰腺癌的早期診斷。

綜上所述，腫瘤細胞快速生長造成組織低氧狀態，誘導HIF-1α高表達，而HIF-1α的高表達又促進VEGF的高表達，VEGF高表達促進血管內皮增殖分裂，進而促進血管形成，從而促進腫瘤生長。而Endostatin可以通過阻斷VEGF通路抑制內皮細胞增殖，有效抑制血管生成。HIF-1α、Endostatin、VEGF三者相互作用共同參與新生血管的生成，在胰腺癌的發生、發展、轉移中起重要作用。

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