線粒體途徑在丹參酮 ⅡA誘導人宮頸癌細胞凋亡中作用

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(1 青島市市立醫院檢驗科，山東 青島 266011; 2 青島大學醫學院生物化學教研室)

丹參用于治療冠狀動脈疾病和腦血管疾病也有逾千年的歷史。從丹參根莖提取的丹參酮ⅡA(TanⅡA)是一種含有醌型結構的脂溶性成分，具有傳遞電子的作用，表現出多種生物活性[1]。我們的前期研究顯示,TanⅡA能降低bcl-2/bax比值，促使HeLa細胞發生凋亡[2]。TanⅡA究竟從何途徑促使HeLa細胞發生凋亡目前所知甚少。線粒體通路是細胞凋亡發生的機制之一。本研究觀察TanⅡA作用下HeLa細胞發生凋亡的特點，從分子水平揭示TanⅡA所致HeLa細胞凋亡的發生機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

新生牛血清、DMEM培養基為Gibco公司產品。細胞色素C(Cyto C)檢測試劑盒購自Biovision公司，化學發光檢測試劑盒購自Santacruz公司。線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)購自碧云天公司。人宮頸癌細胞HeLa細胞株來自中國協和醫科大學基礎學院細胞中心。TanⅡA來自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養和藥物處理 HeLa細胞在含體積分數0.10新生牛血清的DMEM 培養基(含青霉素100 kU/L，鏈霉素100 mg/L)，體積分數0.05 CO2、37 ℃條件下常規培養，細胞在對數生長期時進行實驗，調整細胞密度為2×107/L進行接種。TanⅡA溶于二甲基亞砜(DMSO)中，配成200 mg/L的溶液，過濾除菌保存，實驗時用適量的培養液稀釋至終濃度1.0、2.0、4.0 mg/L。實驗同時設立空白對照組(未加TanⅡA，其他條件完全一致)以及DMSO對照組(DMSO體積分數為0.02)。

1.2.2流式細胞儀檢測HeLa細胞凋亡 TanⅡA處理48 h后收集細胞，在含Annexin V和碘化丙啶(PI)的雙標記液中室溫孵育20 min后，上流式細胞儀進行檢測。用分析軟件Cellquest獲取數據，計算凋亡率。

1.2.3Western印跡法檢測 Cyto C分別提取HeLa細胞細胞質、線粒體蛋白質，定量后行SDS-PAGE凝膠電泳，用電轉印儀將蛋白質轉印到PVDF膜，轉印后的膜依次加入1∶200稀釋的一抗、1∶1 000稀釋的二抗孵育，化學發光法顯色曝光，天能分析軟件分析各蛋白條帶灰度值，結果以Cyto C/β-actin比值表示。

1.2.4流式細胞儀檢測線粒體膜電位 TanⅡA處理48 h后收集細胞，應用JC-1染色液37 ℃孵育20 min后，上流式細胞儀檢測，用ModFit V 1.2軟件分析。正常細胞的線粒體膜電位電壓較高，可形成JC-1的聚集體，發出紅色熒光；而線粒體膜電位降低的細胞，則會形成JC-1單體，發出綠色熒光。

2 結 果

2.1 TanⅡA作用后HeLa細胞凋亡情況

以1.0、2.0、4.0 mg/L的TanⅡA作用48 h后，HeLa細胞凋亡率與空白對照組比較，TanⅡA不同濃度組間比較，差異均有顯著性(F=987.9，q=10.08～75.38，P<0.01)；而DMSO對照組與空白對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 TanⅡA作用后HeLa細胞Cyto C的變化

與空白對照組相比，TanⅡA各劑量組細胞胞質內Cyto C表達明顯增高(F=216.5，q=13.47～29.39，P<0.01)，線粒體內的Cyto C表達則明顯降低(F=1 064.6，q=4.11～68.47，P<0.01)；而DMSO對照組與空白對照組比較，差異無顯著意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同濃度Tan ⅡA作用后HeLa細胞凋亡率及Cyto C表達比較

2.3 TanⅡA作用后線粒體膜電位的變化

與空白對照組和DMSO對照組比較，1.0、2.0、4.0 mg/L TanⅡA作用HeLa細胞48 h后，正常細胞(線粒體膜電位電壓較高)的數量減少，而線粒體膜電位降低的細胞數量增加，差異均有顯著性(F=

116.5、116.5，q=5.79～24.56，P<0.01)。另外，DMSO對照組與空白對照組比較，差異無顯著性(P>0.05)。見表2。

表2 不同濃度Tan ⅡA作用后HeLa細胞線粒體膜電位比較

3 討 論

多項體外實驗結果顯示，TanⅡA對乳癌、肺癌、白血病等多種腫瘤細胞具有抑制增殖、誘導凋亡的作用[3]。本文結果顯示，不同濃度TanⅡA作用HeLa細胞能有效地誘導細胞凋亡，凋亡率呈劑量依賴性。抑制細胞凋亡是腫瘤的標志性特征之一，故誘導腫瘤細胞凋亡已成為一種有效的腫瘤治療的策略與途徑[4]。過去人們認為，凋亡主要是由細胞核的改變引起，現在研究顯示線粒體是細胞存亡的控制中心[5]，線粒體膜電位降低是凋亡的一個早期事件，在凋亡過程中由于線粒體呼吸鏈電子傳遞被中斷，產生自由基，影響能量供應，線粒體膜完整性受到破壞，這些都發生在經典的細胞凋亡特征出現以前。我們前期的研究結果顯示，TanⅡA能降低bcl-2/bax比值，而在生物系統中，異常表達的bcl-2、bax可能引起細胞線粒體結構的破壞，促使Cyto C釋放進入細胞質，最終導致細胞凋亡。此途徑也可能參與了TanⅡA誘導HeLa細胞凋亡的過程。

JC-1即四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物，是一種廣泛用于檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位的理想熒光探針。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以很容易地檢測到線粒體膜電位的下降，線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件，同時也可以將JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。本實驗結果顯示，TanⅡA作用HeLa細胞48 h后，線粒體膜電位降低，且呈明顯的劑量依賴效應。

Cyto C正常定位于線粒體膜間隙中，不能通過線粒體外膜，因此不能在細胞質中檢測到。線粒體結構破壞，線粒體外膜通透性增高，促使Cyto C從線粒體釋放到細胞質中。Cyto C從線粒體釋放至

胞質是引發凋亡關鍵步驟。本文研究結果顯示，TanⅡA 作用HeLa細胞48 h后，與空白對照組相比，正常細胞(紅色細胞)的數量減少，線粒體膜電位降低細胞(綠色細胞)數量增加；細胞胞質內Cyto C表達明顯增高，線粒體內Cyto C表達明顯降低，并且該作用呈劑量依賴性。

綜上所述，TanⅡA能有效地降低HeLa細胞線粒體膜電位，促進Cyto C從線粒體釋放到細胞質中，線粒體途徑可能是TanⅡA誘導HeLa細胞凋亡的機制之一，但其具體作用機制還有待進一步研究。盡管如此，丹參有希望成為臨床治療腫瘤的輔助用藥。

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[2] 沈雋,王照艷,張曉,等. 丹參酮ⅡA對HeLa宮頸癌細胞凋亡的影響[J]. 中國藥房, 2007,18(27):2102-2104.

[3] 翟學敏,和水祥,任牡丹,等. 丹參酮ⅡA對人肝癌SMMC-7721細胞EGF及其受體表達的影響[J]. 浙江大學學報:醫學版, 2009,38(2):163-169.

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[5] 張曉妮,冷傳禮,宋揚. IP6誘導HT-29細胞凋亡中線粒體通路的實驗研究[J]. 齊魯醫學雜志, 2009,24(4):319-323.