RNA干擾survivin基因表達對肝癌細胞放射敏感性影響

，，，

(青島大學醫學院附屬醫院，山東 青島 266003 1 腫瘤科； 2 中心實驗室)

原發性肝癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，目前早期肝癌主要治療手段以外科手術為主，但是90%肝癌病人因腫瘤較大或肝硬化而不宜手術。近年來，三維適形放療(3DCRT)技術大大提高了肝癌的放射劑量，從而提高了肝癌病人的生存率[1-2]。但同時其導致的放射性肝病限制了腫瘤放射劑量的增加。如何提高肝癌的放射敏感性是目前肝癌研究的一個重要方向。survivin基因是一種在腫瘤組織中高特異性表達而在分化正常的組織中沉默的凋亡抑制因子,該基因抑制腫瘤細胞的凋亡并參與血管的生成[3]。survivin基因在肝癌細胞中高選擇性表達，與肝癌細胞放化療抵抗、復發及生存都密切相關，已成為肝癌診療的新靶點。RNA干擾技術常用于阻斷基因表達。本研究通過構建靶向survivin基因的shRNA真核表達載體并轉染肝癌HepG2細胞，探討其對肝癌細胞放射敏感性影響，為RNA干擾survivin基因治療肝癌提供可行性依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 胎牛血清為杭州四季青公司產品；RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司； Lipofectamine 2000轉染試劑盒為Invitrogen公司產品；OPTI-MEM I優化培養基由Invitrogen公司提供；逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)相關試劑購自大連寶生物工程有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)購自Sigma公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司。

1.1.2細胞株 人肝癌細胞株HepG2由我院中心實驗室提供，在含體積分數為0.10胎牛血清的RPMI 1640培養液中培養，置于37 ℃、體積分數為0.05的CO2溫箱中,2～3 d傳代一次，取對數生長期的肝癌細胞開始實驗。

1.2 方法

1.2.1重組質粒的構建 根據RNA設計原則及survivin基因(NM-001168)編碼序列，利用BLAST 進行查詢，并以前期實驗結果為依據[4]，特異性地合成1對針對survivin編碼序列的siRNA 片段，并構建survivin基因的重組載體pshRNA-survivin-387，基因靶點位于survivin基因序列第387位點，靶基因的序列為5′-GAAAGTGCGCCGTGCCATC-3′。重組載體兩端設有Barn HI或Bbs I酶切位點，以利于與pGPH1-GFP-Neo載體連接。按照實驗設計，同時合成陰性對照表達載體pshRNA-survivin-NC及陽性對照表達載體pshRNA-survivin-GAPDH，以上載體均由上海吉瑪公司構建。重組質粒轉入細胞后可表達綠色熒光蛋白，用熒光顯微鏡可確定轉染效率。

1.2.2細胞分組和轉染 轉染前24 h,取處于對數生長期的HepG2細胞，傳代接種于6孔板，每孔加2 mL無抗完全培養基，使每孔細胞數約5×105個，在37 ℃、含體積分數0.05 CO2培養箱中培養，轉染時細胞融合度達70%～90%。分別設置空白對照組(不加液體)、陰性對照組(每孔加入psh-RNA-survivin-NC 4 μg)、siRNA轉染組(每孔加pshRNA-survivin-387為4 μg)。每組各設5個復孔，轉染過程按Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書進行。質粒與脂質體的比例為1∶2.5(m∶V)。轉染后將細胞板置于培養箱中培養，孵育4～6 h后除去復合物，更換培養基，轉染24～48 h后于熒光顯微鏡下計算轉染效率。

1.2.3RT-PCR技術檢測survivin mRNA水平轉染48 h后分別收集3組細胞，調整細胞密度為107/L，采用TrizoL法提取總RNA。RT反應體系為20 μL(包括提取的RNA 2 μL，PrimescriptRTase 1 μL、OligodT 1 μL、dNTP 1 μL和適量5×RTbuffer、氯化鎂)，混勻，于PCR儀上行RT反應，反應條件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，終止反應合成cDNA。PCR擴增體系體積為50 μL，反應條件：94 ℃變性30 s；55 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min，共35個循環。取PCR產物，在含EB的20 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳分離后，以凝膠成像系統分析結果。PCR擴增引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，上游引物序列：5′-TCAAGGACCACCGCATCTCTA-3′，下游引物序列：5′-CCAGCTCCTTGAAGCAGAAGAA-3′。以GAPDH 為內參照。用分析軟件進行相對定量分析，survivin mRNA水平以survivin產物量/GAPDH mRNA產物量的比值表示。

1.2.4X線照射 收集siRNA轉染組細胞，在6 MV直線加速器下給予6 Gy X線照射，再設置空白對照組、陰性對照組、siRNA轉染組、X線照射組，分別接種于6孔板中，使每孔細胞數為2×109/L，置于培養箱中繼續培養48 h。

1.2.5細胞凋亡率的檢測 培養48 h后將各組細胞收集到試管中，制備細胞懸液使其細胞數約為1×106個，置體積分數0.70的冰浴預冷乙醇中，4 ℃固定24 h，離心3 min沉淀細胞，去除上清液，加入1 mL冰浴預冷PBS，重懸細胞，再次離心去上清液，每管細胞加入0.5 mL碘化丙啶染色液(含RNA酶)，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min，4 ℃避光保存。用流式細胞儀對細胞進行DNA含量測定，激發波長為488 nm，根據DNA含量的分布情況進行細胞凋亡分析。細胞凋亡率=亞二倍峰細胞數/細胞總數×100%。

1.2.6MTT法測定細胞存活分數 取對數生長期的HepG2細胞，制成單細胞懸液，調整細胞密度為5×107/L。將細胞接種于96孔板，每孔加入200 μL細胞，每組設4個復孔，置于培養箱中培養72 h。每孔加入5 g/L的MTT各20 μL，繼續孵育4 h，終止培養。離心去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，使結晶物充分溶解，在酶標儀上于490 nm波長處測定各孔吸光度值。細胞存活分數用實驗組的平均吸光值與空白對照組的平均吸光值的比值表示。每組試驗重復3次，取平均值。

2 結 果

2.1 轉染效率

48 h后表達綠色熒光蛋白的細胞轉染效率為60%～80%。

2.2 各組survivin mRNA水平比較

轉染48 h后空白對照組、陰性對照組、siRNA轉染組細胞suvivin mRNA的水平分別為0.319±0.009、0.310±0.007、0.195±0.008，siRNA轉染組survivin mRNA水平與空白對照組和陰性對照組比較顯著下降，差異有顯著性(F=218.931，q=17.73、18.66，P<0.05)；空白組與陰性組比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.3 各組細胞凋亡率比較

空白對照組、陰性對照組、siRNA轉染組、X線照射組、siRNA轉染+X線照射組細胞凋亡率分別為(4.39±0.12)%、(4.31±0.33)%、(9.01±0.33)%、(21.17±0.73)%、(29.52±0.75)%，siRNA轉染+X線照射組細胞凋亡率明顯高于其他各組，差異有顯著性(F=1 421.83，q=13.81～57.48，P<0.05)；siRNA轉染組及X線照射組與空白組、陰性組比較，細胞凋亡率也明顯提高(q=17.55～39.10，P<0.05)。

2.4 各組細胞存活分數比較

空白對照組、陰性對照組、siRNA轉染組、X線照射組、siRNA轉染+X線照射組細胞存活分數分別為(95.25±1.41)%、(92.37±1.37)%、(80.96±0.89)%、(30.84±0.55)%、(19.74±1.13)%，siRNA轉染+X線照射組細胞存活分數顯著低于其他各組，差異有顯著性(F=2 870.578，q=15.32～72.51，P<0.05)；siRNA轉染組及單純X線照射組細胞存活分數與空白組、陰性組比較也明顯降低(q=11.14～73.90，P<0.05)。

3 討 論

survivin是近年來發現的一種凋亡抑制基因，屬于凋亡抑制蛋白家族(IAPs)新成員，其在胚胎組織及腫瘤組織中表達。王滋宗等[5]的研究結果表明，Caspase-3基因表達與survivin基因表達呈顯著負相關。靳秋月等[6]研究顯示，在結腸癌細胞中survivin通過抑制Caspase-3活性，在凋亡途徑的下游發揮抗凋亡作用。近年來研究顯示，survivin在肝癌組織中大量表達。MORINAGA等[7]研究證實了survivin基因高表達與肝癌發生有密切關系。RNA干擾(RNAi)技術是近年來產生的新興生物技術，即將目的基因所對應的小分子雙鏈 (dsRNA)導入生物體并導致相應mRNA降解，從而阻斷哺乳動物細胞中特定基因表達。與傳統基因沉寂療法相比，其主要優點為特異性強、抑制率高、方法便捷，在實驗研究、抗腫瘤基因治療等方面具有廣泛的應用前景。

肝癌在我國發病率較高，其臨床特點為病程短、進展快、預后較差，病死率在消化系統腫瘤中居第3位，傳統治療的中遠期療效均不理想。放射治療作為腫瘤三大常規治療手段之一，在肝癌治療中的地位卻十分有限，主要原因為放射性肝病限制了腫瘤放射劑量的增加。以往研究提示，survivin在肝癌組織中高選擇性表達，該特性為其在原發性肝癌中的治療靶點作用提供了理論依據。目前大量研究表明，抑制survivin基因表達可促進肝癌細胞凋亡及提高化療藥物敏感性[8]。但對于抑制survivin基因表達對放療敏感性的研究仍然較少。

本研究通過構建siRNA真核表達載體，轉染HepG2細胞并經X線照射后進行細胞效應研究。結果表明，轉染pshRNA-survivin-387的HepG2細胞能顯著下調survivin mRNA的表達。本研究結果顯示，siRNA轉染+X線照射組細胞存活分數顯著低于siRNA轉染組，細胞凋亡率明顯升高，提高了肝癌細胞的放療敏感性。MEYN等[9]研究顯示，腫瘤受單一劑量照射后凋亡指數與放射敏感性呈顯著正相關。提示促進肝癌細胞凋亡是siRNA干擾survivin基因表達產生放療增敏效應的機制之一。因此，本實驗為siRNA抑制survivin基因的表達，從而提高肝癌細胞凋亡、提高放療敏感性提供了理論依據，為肝癌基因治療與放療提供了實驗基礎。

[1] 梁世雄,蔣國梁,朱小東,等. 原發性肝癌三維適形放療后放射性肝病的影響因素[J]. 中華放射腫瘤學雜志, 2005,14(4):284-288.

[2] 梁霞,朱小東,梁世雄,等. 原發性小肝癌

三維適形放療的初步結果[J]. 現代腫瘤醫學雜志, 2008,16(5):793-795.

[3] BEIERLE E A, NAGARAM A, DAI W, et al. VEGF-mediated survivin expression in neuroblastoma cells[J]. J Surg Res, 2005,127(1):21-28.

[4] 楊敬敬,雷煒,于壯. RNA干擾survivin基因對人肝癌HepG2細胞增殖的影響[J]. 齊魯醫學雜志, 2009,24(3):199-121.

[5] 王滋宗,魏煜程,沈毅,等. 非小細胞肺癌組織survivin和Caspase基因表達及其關系[J]. 青島大學醫學院學報, 2008,44(4):319-321.

[6] 靳秋月,陳立軍,呼文亮. Caspase-3在survivin反義寡核苷酸誘導人結腸癌細胞HT29凋亡時的表達[J]. 天津醫藥, 2007,35(9):649-651.

[7] M0RINAGA S, NAKAMURA Y, ISHIWA N, et al. Expression of survivin mRNA associates with apoptosis,proliferation and histologically aggressive features in hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep, 2004,12(6):1189-1194.

[8] 孫瑤,雷煒. RNA干擾survivin基因對HepG2細胞凋亡及化療影響[J]. 齊魯醫學雜志, 2010,25(4):303-305.

[9] MEYN R E, STEPHENS L C, ANG K K, et al. Heterog-eneity in the development of apoptosis in irradiated murine tumors of different histologies[J]. Int J Radiat Biol Phys, 1993,64:583-589.